Hto、TAA(トリチウム化した非必須アミノ酸)の曝露と外部曝露は造血と鉄代謝に異なる影響を引き起こす

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環境リスク
Hto, Tritiated Amino Acid Exposure and External Exposure Induce Differential Effects on Hematopoiesis and Iron Metabolism

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6934712/

Jean-Marc Bertho,corresponding author1 Dimitri Kereselidze,1 Line Manens,1 Cécile Culeux,1 Victor Magneron,1 Joel Surette,2 Melinda Blimkie,2 Linsdey Bertrand,2 Heather Wyatt,2 Maâmar Souidi,1 Isabelle Dublineau,3 Nicholas Priest,2 and Jean-René Jourdain4

 

要旨

原子炉や新しい施設からトリチウムが放出される可能性が高まっていることから、ICRPやWHOが推奨するトリチウムの人体への曝露に関する現行の勧告の妥当性が疑問視されている。

トリチウムの潜在的な毒性を線量の関数として研究するために、マウスを10 kBq.l-1,1 MBq.l-1,20 MBq.l-1の3つの濃度のいずれかで飲料水に含まれるトリチウムに慢性的に暴露した。トリチウムは、HTO(酸素と結合したトリチウム水)またはTAA(トリチウム化した非必須アミノ酸)として投与した。

1か月の被曝後、すべてのTAA被曝群で、赤血球(RBC)の線量依存的な減少と鉄分の欠乏が見られたが、HTO被曝群では見られなかった。曝露8カ月後には、この赤血球の減少は平均球容積の増加によって補われ、鉄欠乏に伴う貧血の発生が示唆された。造血、脾臓での赤血球保持、肝臓、腎臓、腸での鉄代謝の解析から、鉄欠乏は腸からの鉄吸収の低下によるものと考えられた。一方、同等の線量率で外部からガンマ線を照射したマウスでは、赤血球数、白血球数、血漿中の鉄濃度に変化は見られなかった。

これらの結果から、健康影響は規制値を超える濃度のトリチウムに慢性的にさらされた場合にのみ現れ、見られる影響はトリチウムのスペシエーション(元素の環境中に存在する化学的形態)に依存することが示された。

対象用語 リスク因子、公衆衛生

はじめに

トリチウムは、現在の原子力発電所(NPP)から放出される主要な放射性核種であり、年間0.1EBqと推定されている1 。環境や人体への影響、特に水の汚染は、これらの放出によって引き起こされる可能性がある。現在のトリチウム規制は、国際放射線防護委員会(ICRP)や世界保健機関(WHO)の勧告に基づいていることがほとんどで、飲料水に含まれる放射性核種による年間曝露量を0.1mSv2に制限することを推奨している。これは、自然起源のトリチウムによる年間推定0.01μSvと比較することができる1。ICRPのトリチウム内部曝露のバイオキネティックモデルを使用し、トリチウムが唯一の線量寄与者であると仮定すると、年間実効線量0.1mSvは、飲料水中のトリチウムのレベルが約7.6kBq.l-1に相当する3。そのため、WHOは、飲料水のトリチウム含有量の規制値として10 kBq.l-1を推奨している2。それにもかかわらず、飲料水のトリチウムに関する各国の基準は、EUの100 Bq.l-1からオーストラリアの76 kBq.l-1まで、数桁の差があり、ほとんどの国がWHOの勧告に従って、10 kBq.l-1に近いかそれ以下の規制値を採用している2,4。各国の規制値の違いは、放射線曝露量を合理的に達成可能な限り低くする(ALARA)ことを求めるICRPの放射線防護原則の適用範囲の違いを反映している。また、トリチウムの潜在的な毒性についての理解が不確かであることも反映している5。

トリチウムを摂取した場合の影響を予測するには問題がある。第一の問題は、トリチウムが崩壊する際に放出されるベータ線のエネルギーが低く(平均5.7keV、最大18keV)その結果、エネルギー付与の軌跡が短くなることである(水中では6μm以下)6。その結果、トリチウムは体内に取り込まれた場合にのみ健康上のリスクとなる。2つ目の問題は、トリチウムの化学形態が多岐にわたることである。環境中のトリチウムの主な化学形態はトリチウム水(HTO)7であるが、トリチウムが炭素原子と共有結合した化合物(有機結合トリチウム(OBT)と呼ばれる)に取り込まれた形態もある。有機結合トリチウムは、生体内のトリチウムの約5~30%を占めており8,人間においても同様である9,10。有機結合トリチウムの形態には、糖、タンパク質、脂質、その他の有機化合物が含まれる。したがって、トリチウムの生体内動態は、その化学種に依存する。HTO型は、体内に均一に分布し、水の入れ替わりが早いことから、毒性が低いと考えられている。対照的に、いくつかの有機結合トリチウムフォームは、臓器や細胞への滞留時間がHTO3よりもはるかに長く、バイオキネティクスが大きく異なる。有機結合トリチウムフォームは、細胞やその核に取り込まれることができ、その結果、細胞に致死的なダメージを与える確率が高くなる11-13。そのため、トリチウムの内部曝露によるリスクは過小評価されているのではないかと推測されている14,15。

トリチウムの取り込みによる健康への影響を探る疫学研究は少なく、トリチウムの毒性に関する情報はほとんどない1,16。これは、職業上のトリチウム線量が一般的に職業上の総線量に統合されているため、トリチウム単独のリスクを分析することができないことが一因である17。いくつかのケースでは、トリチウム被曝を個別に考慮した分析が行われたが、これらの研究は統計的検出力が不十分であったため、参考にならなかった18,19。このことから、トリチウムの内部曝露による健康への影響に関する研究の多くは、動物モデルを使用している。これらの研究では、催奇形性20,発癌性21,造血関連の致死性22が示されている。しかし、これらの研究のほとんどは、GBq台のトリチウム量への急性曝露を採用している。このような曝露は、原子力発電所の周辺であっても、環境中の濃度よりも数桁高く23,24,ほとんどの場合、HTO1に曝露している一方、環境に適した濃度のトリチウムに慢性的にさらされた場合の健康への影響についての研究は少ない。いくつかの慢性曝露研究では、発がん性による寿命の短縮が示されているが、それらは1日あたり4~250mGy21,25に相当するトリチウム濃度を使用しており、現在の規制値よりも数桁高い値である。このような知識のギャップを埋めるために、大規模なマウスの生体内試験研究が行われ、ヒトの被曝の可能性や現行の規制に関連する低濃度のトリチウムの組み込みによるバイオキネティクスと非がん性/発がん性の影響が研究された。この大規模な研究の詳細は公表されている26。

使用したトリチウムは、HTOと有機結合トリチウム(アラニン、グリシン、プロリンの3種類のアミノ酸(AA)の混合物の形)の2種類である。これらのアミノ酸(以下TAA)を選んだ理由はいくつかある。これらのアミノ酸(以下TAA)を選んだ理由は,水への溶解性が高く,飲料水への添加による曝露管理が容易であること27,28,通常のAA代謝プロセスに関与する非必須アミノ酸であること29,脊椎動物のタンパク質に多く含まれていること30,プロリンを除き,主要な代謝経路に関与しない非機能性AAであること30である。プロリンは、浸透圧調節、ストレス防御、細胞内シグナル伝達プロセスなど、いくつかの代謝経路に関与しており、最近ではがん細胞の代謝にも関与していることがわかっている30。

最後に、トリチウムのベータ線は飛程が短く(6µm以下)エネルギーも低いことから、6トリチウムは放射性毒性の低い核種と考えられている。しかし、マイクロドジメトリレベルでは、特に有機結合トリチウムが細胞や組織の構造要素に取り込まれた後に、エネルギーの集中的な蓄積が起こる可能性がある。このような集中的なエネルギー付与は、予想以上に高いリスクをもたらす可能性がある14,15。これを調べるために、より均一に分布しているコバルト60からのガンマ線を、同じ線量と線量率で比較した。このようにして、HTO/有機結合トリチウムとガンマ線によって生じる観察された生物学的効果を比較することができる。この研究では、TAAに1カ月間暴露した後、赤血球数の減少が見られたが、HTOや、トリチウムへの内部暴露から生じるものと同等の線量率の外部ガンマ線には暴露しなかった。本研究では、血液学的パラメータの詳細な分析を行い、観察されたトリチウムによる変化と鉄代謝の変化との関連性について検討した。

 

結果

血球の数と計算式

HTOまたはTAAのいずれかに1ヶ月間曝露した後、白血球および血小板の数と割合は対照動物と比べてほとんど変化がなかった。例外として、20MBq.l-1のトリチウムを浴びた両群では、好中球の数がわずかに減少した(図1)。一方,赤血球(RBC)数の有意な減少は,トリチウム濃度にかかわらずTAA曝露群のすべてで認められたが,HTO曝露群では認められなかった(図2A)。この赤血球数の対照値と比較した4〜6%の減少は、1および20MBq.l-1被曝群において、ヘモグロビン濃度の低下、ヘマトクリットの低下、および平均赤血球量の低下と関連していた(図2B-D)。これらの変化は、20MBq.l-1被曝群でMGVがわずかに増加したことを除いて、HTO群では見られなかった。この結果は,TAAに被曝した動物では,HTOに被曝した動物ではなく,TAAに被曝した動物では,用量依存的に赤血球が減少していることを示している。このような赤血球パラメータの減少が、貧血の原因となるかどうかは判断が難しい。というのも、C57 BL/6Jの生後3カ月の赤血球数の正常な中央値は8.97×1012.l-1であるのに対し、非常に大きな範囲(2.9~11×1012.l-1)があるからである。また、年齢やマウス系統の由来、地域の動物飼育環境によっても大きな違いがある31。さらに、マウスモデルにおける貧血の基準となる赤血球またはヘモグロビンの減少値は定義されていない。ヒトでは、ヘモグロビン濃度が男性で130g.l-1以下になると貧血と定義されている。我々の手では、コントロールと比較してヘモグロビン濃度が4~5.2%、赤血球数が4~6%減少した。これは大きな減少ではないので、「軽度の貧血」という言葉を使うことにした。

 

図1 HTOまたはTAAのいずれかに1ヶ月間曝露した後の動物の血球数および差

 

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(A)白血球、(B)リンパ球、(C)単球、(D)好中球、(E)血小板。結果は平均±SD、n=11。好中球(H(6)=16.5,p=0.011)を除き、対照群との有意差が認められたが、一元配置のANOVA検定では、異なる暴露群に有意差は認められなかった。

 

 図2  HTOまたはTAAのいずれかに1ヶ月間曝露した後の動物の赤血球パラメータ

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A)赤血球数、(B)ヘモグロビン、(C)ヘマトクリット、(D)平均球状体体積(MGV)(E)ヘモグロビン中の平均球状体含有量(MCCH)(F)赤血球分布指数(RDw)。結果は平均±SD、n=11。一元配置のANOVA検定では、赤血球数(H(6)=15.2,p=0.005)ヘモグロビン(H(6)=15.2,p=0.018)ヘマトクリット(H(6)=15.4,p=0.018)MGV(H(6)=16.5,p=0.011)に有意な差が認められたが、MCCHには有意な差は認められなかった。また、水平方向の破線がある場合は、対照群の平均値を示している。この結果から、TAAに1ヶ月間曝露した後、貧血が出現したが、HTOには出現しなかった。

 

8ヵ月後には、赤血球数はコントロール値に戻り、ヘモグロビン濃度とヘマトクリットも戻った(図3A-C)。しかし,赤血球パラメータでは,主に高濃度のTAAに暴露された動物において,平均赤血球体積(MGV)の増加(図3D),平均赤血球中ヘモグロビン濃度(MCCH)の減少(図3E),赤血球分布幅(RDw)の減少(図3F)が見られた。HTO曝露群では、MGVのわずかな増加が観察されただけで、他の赤血球パラメータには付随する変化は見られなかった。このことは、TAA曝露群において曝露1カ月後に観察された赤血球の減少は、循環中の赤血球の半減期の増加によって補われ、赤血球の平均容積の増加とMCCHの減少につながったことを示唆している。これはTAA曝露によって誘発された軽度の貧血に対応するものであり、同じ濃度のHTOに曝露した動物では観察されなかった。

41598_2019_56453_Fig3_HTML.jpgである。

 

図3 HTOまたはTAAに8ヶ月間曝露した後の動物の赤血球パラメータ

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A)赤血球数、(B)ヘモグロビン、(C)ヘマトクリット、(D)平均球状体体積(MGV)(E)ヘモグロビン中の平均球状体含有量(MCCH)(F)赤血球分布指数(RDw)。結果は平均±SD、n=11。One-way ANOVA testを用いて、MGV (H(6) = 15.2, p = 0.005)、MCCH (H(6) = 15.2, p = 0.018)、RDw (H(6) = 15.4, p = 0.018)については有意差が認められたが、RBC数、ヘマトクリット、ヘモグロビンについては有意差が認められなくなった。対照群との有意差は,主にTAA曝露動物に見られた。横の破線は,対照群の平均値を示す。

 

赤血球の分化と排泄の制御

貧血の原因には,骨髄での赤血球の分化不全や,脾臓での赤血球の保持不全などが考えられる。そこで、この2つの仮説を検討した。

造血幹細胞からの赤血球分化は、いくつかのメカニズムによって厳密に制御されており、その中でもサイトカインの制御は特に重要である32。私たちはまず、体内でEPOが産生される主な場所である腎臓におけるEPO mRNAの発現を調べた33。その結果(図4A)EPO mRNAの相対的な発現量は、曝露1ヵ月後および8ヵ月後のいずれにおいても、すべての曝露群で同じレベルであったことから、観察された軽度の貧血に腎臓でのEPO産生は関与していないことが強く示唆された。次に、動物の血漿中の造血調節に関与する10種類のサイトカインを測定した。特に、赤血球前駆細胞の終末分化を調節するEPO33と、造血の生体指標として用いられるFlt3-l34,35を測定した。図4B,Cに示すように、Flt3-lとEPOの血漿中濃度は、曝露群と比較して有意な差は認められなかった。Flt3-l濃度が正常であることは、正常な造血幹細胞の分化を示す有力な指標であり、EPO濃度が正常であることは、正常な終末期赤血球の分化を示す指標である。これらの結果は、1ヶ月後に観察された貧血の起源は、赤血球分化の欠損とは関係ないことを示唆している。しかし、Flt3-l濃度の有意な上昇は、曝露1カ月後に比べて曝露8カ月後に観察され(二元配置アノバ検定、F(1, 132) = 7.21, p = 0.008)特にTAA 20 MBq.l-1群で顕著であったことに留意すべきである(p < 0.05)。このFlt3リガンド濃度の上昇は、対照群を含むすべての実験群で認められたことから、この効果はトリチウムへの曝露によるものではなく、動物の年齢が上がったことによるものと考えられる。その他のサイトカイン(G-脳脊髄液、M-脳脊髄液、SDF-1,TPO)については、被曝群および被曝期間のいずれと比較しても変化は見られなかった(データは示さず)。循環サイトカインの分析により、赤血球の減少が造血の欠陥につながらないことが確認された。

図4

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(A) トリチウムに1ヶ月または8ヶ月曝露した動物の腎臓におけるエリスロポエチン(EPO)のmRNA相対発現量。対照群(破線)と比較して、mRNAの相対的な発現に有意な変化は見られなかった(一元配置のANOVA検定)。(B) 血漿中のEPO濃度。曝露群と曝露期間のいずれにも有意な変化は認められなかった(二元配置分散分析)。C)Fms-like tyrosine kinase 3 ligand(Flt3-l)の血漿中濃度。曝露群の違いによる有意な変化は認められなかったが、曝露期間の長さに応じてFlt3-l濃度の有意な上昇が認められた(二元配置分散分析、F(1, 132) = 7.21, p = 0.008)。すべての結果は、平均値±SD、n=11で示した。


代替仮説として、赤血球数の減少は、脾臓内での赤血球の過剰な滞留によるものである可能性がある。そこで、赤血球のマクロファージへの接着に関与する接着分子であるCD36,ヘムのリサイクルに関与するヘムオキシゲナーゼ-1(HMOX-1)鉄輸送に関与する2つの分子である2価の金属トランスポーター1(DMT-1)と鉄調節トランスポーター(IREG)など、多くの分子のmRNA発現レベルを測定した。図5A,Bに示すように、HTOとTAAの両被曝群において、CD36 mRNAとDMT1 mRNAの相対的な発現量に、被曝1カ月後に変化が見られた。HMOX-1とIREGについても同様の結果が得られた(データは示さず)。これらの変化は、赤血球数に見られたわずかな貧血が、1ヶ月間の曝露後に脾臓での赤血球の捕獲が減少することで調節されているという仮説と一致する。興味深いことに、8カ月間の曝露後、CD36,HMOX、DMT1,IREGの相対的な発現が正常化した。これは、血液中の赤血球数に見られる正常化と一致する。この結果から 1カ月後に脾臓に赤血球が滞留することで、赤血球数の調節が容易になることが確認された。これを確認するために、脾臓のCD36およびHMOXの発現に関する組織学的および免疫組織学的分析を行った。図5Cは、曝露1ヶ月後の脾臓の典型的な形態を示し、図5Dは、脾臓の全表面に対する赤血球滞留部位である赤脾の比率に変化がないことを示している。このことから、HTOまたはTAAに暴露しても、赤血球が減少していることから、脾臓の組織学的な変化は見られないことがわかる。CD36とHMOX1の染色では、脾臓に正常な発現パターンが見られ(図5E,F)グループや曝露期間による変化は見られなかった。これらの組織学的結果とmRNA発現に見られる変化との間に矛盾があるのは、組織学的分析の感度が不十分であったためであると考えられる。脾臓の分析結果から、曝露1カ月後に観察された赤血球数の減少は、脾臓内での赤血球の滞留が減少することで制御されており、この滞留は曝露8カ月後には正常に戻ったことが示唆された(対照群と比較して赤血球数が正常に戻った時期)。このことから 1ヵ月後に観察された赤血球の減少は、脾臓内の赤血球保持量の変化とは関係なく、むしろ脾臓で観察された変化は、赤血球減少に対する補償メカニズムと関係していることが確認された。そして、観察された軽度の貧血を説明しうる他の仮説を検討した。

図5

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曝露動物の脾臓の分析。A)CD36 mRNAおよび(B)DMT1 mRNAの相対発現量を、トリチウムに1ヶ月または8ヶ月曝露した動物の脾臓で調べた。対照群(破線)と比較して、曝露1ヶ月後にmRNA相対発現の有意な変化が観察されたが(一元配置のANOVA検定)曝露8ヶ月後には観察されなかった。(C,D) 1ヶ月または8ヶ月の曝露後の脾臓の肉眼形態学的分析。C)対照動物の1ヶ月後の脾臓のHES染色による代表的な形態で、赤髄はピンク色に、胚中心は濃い青色に、辺縁帯は水色に見える。D)曝露1ヶ月後(開いた棒)または曝露8ヶ月後(ハッチングした棒)の脾臓のヒストモフォロジー分析。脾臓の表面に占める赤肉の割合は、曝露群や曝露期間による変化は見られなかった(二元配置のANOVA検定)。(E,F) 曝露1ヶ月後の曝露動物の脾臓におけるHMOXおよびCD36の発現を免疫組織学的に分析した。E)曝露1ヶ月後の対照動物において、主に胚中心に核染色を示す代表的なHMOX染色(矢印、上パネル)と、赤脾に均質な細胞質染色を示す代表的なCD36染色(矢印、下パネル)。E)1ヶ月間曝露したマウスの脾臓におけるCD36染色の免疫・ヒスト・形態学的分析。曝露群によるCD36発現の有意な変化は認められなかった(一元配置分散分析法による検定)。


 

血漿中の鉄およびタンパク質の測定

貧血の発症に関与していると考えられるもう一つの経路は、鉄代謝の欠損である。そこで、曝露動物と非曝露動物の血漿中の鉄および鉄代謝に関連するタンパク質、すなわちフェリチン、トランスフェリンおよびセルロプラスミンを測定した。その結果(図6B)10 kBq.l-1と20 MBq.l-1のグループでは、TAAに8ヶ月間曝露した後、鉄の血漿中濃度に変化が見られ、1 MBq.l-1のグループでは(有意ではないが)鉄の血漿中濃度に変化が見られた。一方、HTOとTAAのどちらの被曝群でも、被曝1か月後には変化が見られなかった(図6A)。これは、1か月間の赤血球の減少が、赤血球の半減期の増加と8か月間のMCCHの減少によって調節されていることと一致する。しかし、血液中の鉄輸送に関与するタンパク質、すなわちフェリチン(図6C,D)トランスフェリン(図6E,F)およびセルロプラスミン(データは示さず)は、曝露期間にかかわらず、曝露による変化は見られなかった。これらの結果は、1ヶ月後に観察された赤血球の減少が、8ヶ月後には赤血球の寿命と大きさの増加によって補われたことは、HTOではなくTAAに曝露されたことによる鉄分の欠陥であることを強く示唆している。

図6 1ヶ月間(A,C,E,G)および8ヶ月間(B,D,F,H)曝露した動物における(A,B)血清鉄、(C,D)フェリチン、(E,F)トランスフェリンおよび(G,H)ヘプシジンの血漿測定結果

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結果は10匹の平均±SDで示し,一元配置分析の結果は,各パラメータおよび暴露期間ごとに示した。多重比較法(Dum’s method)を用いて、*p < 0.05で対照群との有意差が認められた。対照群は各曝露期間における相対的な遺伝子発現の基準となったため、1ヶ月間の曝露によるデータと8ヶ月間の曝露によるデータを比較することはできなかった。

興味深いことに,鉄代謝の制御に強く関与している分子であるヘプシジンについて見ると,血漿中のヘプシジン濃度は,曝露1カ月後に減少し(図6G),曝露8カ月後に増加した(図6H)。いずれも主にTAA曝露群で見られた。ヘプシジンは、肝臓のエリスロフェロン(ERFE)によって負に制御されており38,39,血中のヘプシジン濃度は、特に腸での鉄の取り込みを増加させることによって、血中の鉄のバイオアベイラビリティを制御している40。我々は、血漿中のERFEの測定を試みたが、すべての測定値は検出限界(0.15ng/ml)を下回り、血液中のERFE濃度は正常であることがわかった39。このことから、主に8ヶ月間の曝露後に見られる鉄分の異常は、肝臓の鉄分調節機能か、腸の食物からの鉄分吸収能力のいずれかに起因すると考えられる。

肝臓と腸での鉄代謝

次に、肝臓での鉄の代謝について調べた。まず、肝臓の抽出液中の鉄濃度を調べた。その結果、鉄濃度は、曝露1ヶ月後、8ヶ月後のいずれにおいても、曝露群による変化は見られなかった(Two-way anova, F(6, 126) = 0.417, n.s.)(図7A)。また、フェリチン濃度には、曝露群に応じた変化は見られなかった(二元配置のアノバ、F(6, 126) = 1.136, n.s.)(図7B)。比較すると、対照を含むすべての曝露群において、曝露1ヶ月後に比べて曝露8ヶ月後には鉄濃度の有意な上昇が観察され(F(1, 126) = 50.22, p < 0.001)曝露期間によるフェリチン濃度の有意な減少も観察された(F(6, 126) = 11.51, p < 0.001)。しかし、これらの鉄およびフェリチン濃度の変化は、非被爆者である対照群にも認められたことから、これらの変化は加齢によるものと思われた。また、鉄代謝の変化がないことを確認するために、ヘプシジン、ERFE(図7C,D)DMT1,IREG、フェリチン鎖HおよびL、トランスフェリン受容体1および2をコードするmRNAの発現を確認した。しかし、これらのmRNAの発現に有意な変化は認められなかった。ただし、ERFEはTAA曝露1カ月後に発現が減少したが、曝露8カ月後やHTO曝露後には減少しなかった(図7D)。ERFEの肝臓での発現低下は、曝露1カ月後に見られた血漿中のヘプシジン濃度の低下を説明するものと思われる。また、曝露8カ月後にERFEの発現が対照値に戻ったことも、血漿中のヘプシジン濃度が上昇したことの説明になるかもしれない。ERFEの発現が負に制御されていることは、1ヶ月間の曝露後に観察された赤血球の減少の結果であることが示唆され、TAA曝露による赤血球の減少は、肝臓による鉄調節の欠陥に起因するものではないことが示された。

図7 肝臓での鉄代謝

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A)肝臓抽出液中の鉄濃度および(B)フェリチン濃度、各群10匹の平均値±SDで表した。鉄濃度(A)については、二元配置のアノバ分析により、曝露期間(これは年齢効果に関連する)による有意差(F(1, 126) = 50.2, p > 0.001)が認められたが、曝露群による有意差は認められなかった(F(6, 126) = 0.42, n.s.)。フェリチン濃度(B)については、曝露期間による差が有意(加齢効果)(F(1, 126) = 11.5, p > 0.001)であるが、曝露群による差はない(F(6, 126) = 1.14, n.s.)。同じ曝露群内での曝露1ヶ月と8ヶ月の間の差は、*p < 0.05および**p < 0.001で示されている。(C,D) 1ヶ月(左パネル)または8ヶ月(右パネル)の曝露後のヘプシジン(C)およびエリスロフェロン(D)のmRNA発現。結果は10匹の平均値±SDで示し、各グラフには一元配置のアノバまたはランク分析のアノバの結果を示した。多重比較法を用いた対照群との有意差は,*p < 0.05で示した。対照群が各暴露期間における相対的な遺伝子発現の基準となっているため、1ヵ月暴露のデータと8ヵ月暴露のデータを比較することはできなかった。


消化管での鉄の取り込みを調べるために、腸内での鉄の代謝を調べた。粘膜抽出液中の鉄濃度を測定したところ、曝露群による変化は見られなかったが(二元配置のアノバ、F(6, 126) = 0.42, n.s.)曝露期間に応じて有意な増加が見られた(F(1, 126) = 50.2, p < 0.001)(図8A)。また、HTO 10 kBq.l-1と1 MBq.l-1,TAA 20 MBq.l-1の被曝群では、1ヶ月と8ヶ月の間に有意な差が見られた。この結果は、腸管粘膜への鉄の蓄積量の増加を示唆している。同様に、曝露群によるフェリチン濃度の変化は見られなかったが(F(1, 126) = 1.14, n.s.)曝露時間に応じてフェリチン濃度の有意な低下が見られた(F(1, 126) = 11.5, p < 0.001)(図8B)。

図8 腸内での鉄代謝

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(A)腸粘膜抽出液中の鉄濃度と(B)フェリチン濃度を、1群10匹の平均±SDで表した。鉄濃度(A)については、二元配置のアノバ分析により、曝露期間(年齢効果に関係する)による有意差(F(1, 126) = 50.2, p > 0.001)が認められたが、曝露群による有意差は認められなかった(F(6, 126) = 0.42, n.s.)。フェリチン濃度(B)については、曝露期間による差が有意である(加齢効果)(F(1, 126) = 11.5, p > 0.001)が、曝露グループによる差はない(F(6, 126) = 1.14, n.s.)。多重比較法で検定した各曝露群内での曝露1ヶ月と8ヶ月の間の差は、*p < 0.05および**p < 0.001で示されている。(C,D) フェリチンL(C)およびDMT1(D)のmRNA発現を、1ヶ月(左パネル)または8ヶ月(右パネル)のいずれかの曝露後に調べた。結果は10匹の平均値±SDを示し,各グラフには一元配置のアノバまたはランク分析のアノバの結果を示した。多重比較法による対照群との有意差は,*p < 0.05および**p < 0.001で示した。対照群は、各暴露期間における相対的な遺伝子発現の基準となったため、1ヶ月の暴露のデータと8ヶ月の暴露のデータを比較することはできなかった。


これらの変化を確認するために、DMT1,IREG、HMOX、HIF-2α、フェリチンチェーンHおよびL、トランスフェリン受容体1をコードするmRNAの発現を確認した。フェリチンL鎖(図8C,D)を除いて、これらの遺伝子の発現に変化は見られず、1ヶ月後(F(6, 51)=48.67, p < 0.001)と8ヶ月後(F(1, 51)=19.77, p < 0.001)の両方でmRNAの発現に強い減少が見られた(図8C)。さらに、フェリチンをコードするmRNAの発現低下は、HTO曝露群でも若干の変化が見られたものの、主にTAA曝露群で観察された。このことは、腸管粘膜抽出物中のフェリチンタンパク質濃度の低下と一致しており、TAAに暴露された動物に観察された赤血球の減少は、腸内での鉄分捕捉の欠陥に起因する可能性を示唆している。

そこで、対照群、HTO群、TAA 20 MBq.L-1群において、曝露1ヵ月後または8ヵ月後に腸の組織学的変化を検出するために、腸の組織形態学的分析を行った。ポリペプチドやAAの吸収は主に十二指腸と空腸近位部で行われるため、この組織形態学的分析は空腸近位部で行った41,42。HES染色の結果、絨毛の長さと表面は、1ヶ月後(図9A-C)と8ヶ月後(データは示さず)には変化していなかった。また、DMT1とトランスフェリン受容体(TfR)の2つの分子の発現を調べた。DMT1は主に核内で染色され(図9D)TfRは主に腸のクリプト部と絨毛の基底部で発現していた(図9G)。また、対照群と2つの曝露群の間では、1ヵ月後の曝露でも、染色強度や染色面の割合に有意な変化は見られなかった(図9E,F,H,I)。これらの結果は、フェリチンと鉄について検出された分子変化は、腸壁の大きな組織学的変化とは関連していないことを示唆している。これは、曝露期間や曝露群にかかわらず、腸管上皮細胞内のアポトーシスや増殖に大きな変化がないことを示す従来の結果を確認し、さらに発展させたものである26。

図9 腸の組織学的および免疫組織学的分析

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(A) 腸切片のHES染色。絨毛(大きな矢印)とクリプト(細い矢印)の正常な外観を示す。細胞質はピンクに、核は濃紺に染色されている。(B,C) 絨毛の形態学的分析。対照のHTO 20 MBq.l-1群とTAA 20 MBq.l-1群について、絨毛の高さ(B)と絨毛の表面を用いて分析した。対照群と被曝群の間に有意な差は認められなかった(Student’s t test)。(D) 腸の免疫組織学的染色で、DMT1の発現を確認した。ダークブルー(矢印)で現れ、核のfast redで対抗染色した。DMT1は主に絨毛の細胞の核に発現しており、絨毛の基底部やクリプトでは発現が少ない。(E,F) DMT1の染色を分析した結果、HTOまたはTAAのいずれかに曝露しても、染色強度(E)および表面の染色(F)は、対照群と比較して有意に変化しないことが示された(Student’s t test)。G)腸のトランスフェリン受容体(TfR)の免疫組織学的染色。TfRは主にクリプトと絨毛の基底部に発現していることがわかる。TfRの染色はダークブルー(矢印)で表示され、核のファストレッドがカウンターステインとして表示されている。(H,I) TfRの染色を分析した結果、染色強度(H)および表面の染色(I)は、対照群と比較して、HTOまたはTAAのいずれかに曝露しても有意に変化しないことが示された(Student’s t test)。


外部からのガンマ線照射が赤血球および鉄代謝に及ぼす影響

並行して行った実験では、トリチウム照射に用いた線量率でマウス群を照射した。線量は、以前に行われたバイオキネティック研究43-45で得られたデータを用いて計算した。使用した線量率は,1.4µGy.h-1(曝露ホールで達成可能な実用的な最低線量率)と31.2µGy.h-1で,それぞれ飲料水のTAA濃度1MBq.l-1と20MBq.l-1に相当する。血球数の測定結果では、被曝1か月後、8か月後ともに、WBC数、RBC数ともに有意な変化は見られなかった(図10A,B)。また、ヘマトクリットやヘモグロビン濃度にも有意な変化は見られず(図10C,D)外部からガンマ線を照射した動物には貧血がないことがわかった。この結果を確認するために、鉄代謝に関連する血液パラメーターを測定した。照射動物の血漿中のセルロプラスミン濃度やトランスフェリン濃度は、照射期間にかかわらず、対照動物と比較して変化は見られなかった。しかし、鉄濃度の減少(F(1,64)=20.84,p<0.001)とフェリチン濃度の増加(F(1.58)=19.05,p<0.001)は、被曝期間に応じて観察されたが(図10E,F)線量率に応じて観察されたわけではない。これらの結果から、見られた変化は動物の加齢によるものである可能性が高いと考えられた。このことは、8ヵ月後の対照群では、1ヵ月後の対照群に比べてフェリチン濃度の低下が観察されたことからも示唆される。以上の結果から、トリチウム等価体(HTOまたはTAA)の外部ガンマ線照射は、血液学的パラメータおよび鉄代謝のいずれにも変化を誘発しないことが示された。

図10 1MBq.l-1および20MBq.l-1の内部曝露に相当する1.4μGy.h-1および31.2μGy.h-1の2つの線量率の外部ガンマ線照射が血液パラメータに及ぼす影響

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A)白血球(WBC)数、(B)赤血球数、(C)ヘマトクリット、(D)ヘモグロビン濃度、(E)血清鉄濃度、(F)フェリチン濃度。血清鉄濃度(F(1, 64) = 20.84, p < 0.001)およびフェリチン濃度(F(1, 58) = 19.05, p < 0.001)については、二元配置のアノバ検定を用いて、曝露期間に応じた有意差が観察されたが、適用された線量率の関数としては観察されなかった(鉄についてはF(2, 64) = 0.093, n.s.、フェリチンについてはF(1, 58) = 0.90, n.s.)。

 

考察

鉄分の代謝には、脾臓、腎臓、肝臓、骨髄、腸など複数の臓器の生理機能が複雑に絡み合っている46。最初に観察された曝露1ヶ月後の赤血球数の減少と、その後の曝露8ヶ月後の赤血球体積の増加(したがって寿命)による補正は、主に曝露8ヶ月後に見られる血中の鉄の利用可能性の低下と明らかに関連している。赤血球数の減少は4-6%、ヘモグロビン濃度の減少は4-5.2%であり、これは限定的な貧血である。

 

脾臓に見られた暴露1ヶ月後の変化は、赤血球数の減少に対する適応メカニズムに直結しており、赤血球の脾臓内での滞留が減少し、赤血球の寿命が延びたことによる。対照的に、血中のヘプシジン濃度の低下は、ERFEとヘプシジンの相互作用による赤血球数の調節ループに関連している可能性が高い47。ヘプシジン濃度の低下は、腸での鉄の取り込み増加と相関しており48,49,おそらく骨髄または肝臓でERFEの放出が増加していることが原因と考えられる39。残念ながら、骨髄でのERFEの発現や濃度を調べることはできなかった。また、血漿中のERFEは0.15ng.ml-1以下であり、血液中のERFE濃度は正常であることがわかった39。曝露1カ月後の血液中のヘプシジンがともに減少していること、ヘモグロビン量が赤血球の寿命増加によって補われていることから、赤血球の減少は、腸での鉄の捕捉障害、あるいは腎臓での鉄の排泄の増加のいずれかに起因すると考えられる。これまでの結果では、尿中の生化学的パラメータで評価すると腎機能は正常に見えるが、炎症と酸化ストレスの明確な増加が観察された26。腎機能が正常であることは、EPO mRNAの発現が正常であり、血液中のEPO濃度が正常であるという我々の結果と一致していた。一方、腸では、曝露1カ月後および8カ月後のいずれにおいても、フェリチンmRNAの発現の強い低下が観察され、腸粘膜への鉄の蓄積と関連していた。このことから,TAAへの曝露により,腸内での鉄の捕捉や輸送に持続的な欠陥が生じ,その結果,鉄の利用可能性が低下し,赤血球数が減少することが示唆された(図11)。このような観点から、8ヵ月間の曝露後に血漿中のヘプシジン濃度が上昇したことは興味深い。実際、このような増加は、限定的ではあるが、腸の鉄をアップロードする能力の低下を増幅させるループとして作用している可能性がある。曝露8カ月後のヘプシジンのわずかな増加は、肝臓におけるERFEの発現がコントロールレベルに戻ったことと関連している可能性がある。

 

図11 TAA、HTO、外部照射を1カ月または8カ月受けた後に得られた結果と、観察された結果を説明する可能性のある仮説を示す模式図

 

仮説は、TAAによって腸内に生じた局所的な損傷により、フェリチンの発現が低下し、その結果、腸管バリアを介した鉄の輸送能力が低下したというものである。鉄の利用が不十分になった結果、曝露1カ月後には脾臓で赤血球の減少と鉄代謝の変化が見られた。腸内の持続的な損傷と鉄の蓄積により、8ヵ月後には血液中の鉄が不足することになる。MGV(平均赤血球容積)の増加は、1ヶ月間で減少した赤血球数を補うメカニズムであると考えられる。血中のヘプシジン濃度が低い場合、1ヶ月目に腸による鉄の捕獲を積極的に制御しているように見えるが、TAAの継続的な存在による持続的な損傷のために有効ではない。このような局所損傷は、放射線量と損傷の分布が均一であるため、HTOや外部照射では誘発されない。


 

本研究で選択したTAAは非必須のAAであるため、食事に含まれるAAの量で希釈される。固形飼料には18%の粗タンパク質が含まれており、脊椎動物のタンパク質には平均して9%のアラニン、7.5%のグリシン、4.6%のプロリンが含まれていること29,成体マウスは1日に約3.2gのチョウを食べること27,28を考慮すると、最高活性(20 MBq.l-1)のTAAを飲料水に添加した場合の希釈率をチョウのAA含有量で推定することができる。その結果、希釈率は1.10-7から 1.10-8の範囲であることがわかった。したがって,このような量のTAAを動物の食餌に添加することで,化学的毒性が誘発されたり,プロリンの代謝活動への影響が増大したりする可能性は極めて低いと考えられる30。このことは、鉄代謝に対するTAAの効果が、これらのAAに含まれるトリチウムの放射線作用によるものであることを強く示唆している。

興味深いことに,鉄代謝に対するトリチウムの影響は,主にTAAに曝露した場合に観察され,HTOの形でトリチウムを曝露した場合にはほとんど変化が見られず,同等の線量率の外部照射でも変化は見られなかった。さらに、TAA曝露の影響は、赤血球のパラメータ、脾臓におけるCD36およびDMT1 mRNAの発現には1ヶ月の曝露後、腸粘膜におけるフェリチンmRNAの発現には1ヶ月および8ヶ月の曝露後のいずれにおいても用量依存性が見られたこれらの結果は、トリチウムのスペシエーションの重要性を示している。実際、HTOは、以前に説明したように、体内で均一に分布しており、そのほとんどが交換可能な水のコンパートメントである44。その結果、特にトリチウムの崩壊によって放出されるベータ粒子の範囲が非常に短い(<6 µm)ことを考慮すると、線量分布も極めて均一である6。対照的に、アミノ酸は細胞の細胞質に入り込み、細胞の代謝プロセスに関与するため、より不均一に分布する可能性がある。例えば、腸上皮、特にアミノ酸が腸細胞によって吸収される絨毛の基底部50では、血液に輸送される前にTAAが濃縮される可能性がある。さらに、AAは主に十二指腸と空腸の上部で吸収される42。最後に、AAのかなりの割合(AAによっては最大50%)が腸細胞によって異化される41。したがって,マイクロドジメトリのレベルでは,TAAの局所的な濃度が腸細胞内で発生し,それが細胞障害の発現に寄与している可能性を否定できない。このようなTAAの局所濃度は,以前に説明したように腸全体のトリチウム量を測定するバイオキネティクス実験では観察されない可能性がある44。私たちは、このような細胞損傷は、腸内ではフェリチンの発現低下として現れ、その結果、腸上皮における鉄輸送の欠陥が生じ(図11)1ヶ月間の曝露後に軽度の貧血が生じるのではないかと考えた。このような粘膜細胞による鉄捕捉の阻害は、すでに報告されている51。したがって、その他のすべての変化は、この腸内の鉄輸送障害に起因すると考えられる。しかし、生体内の他の場所でTAAが局所的に濃縮されることによって損傷が生じた可能性も否定できない。しかし、本研究で使用した同じマウスの様々な組織における毒性を分析した結果、組織や代謝の主要な部分に特異的な影響が見られなかったことから、その可能性は低いと考えられる26。この仮説は、多糖類や脂質など、代謝挙動の異なる他の形態の有機結合トリチウムを用いて検証することに興味がある。これらの異なる有機結合トリチウムフォームの局所的な蓄積に応じて、異なる生物学的効果が観察されるという仮説を立てることができる。このような観察結果は,TAA摂取による鉄代謝への間接的な影響を説明する我々の仮説と一致するだろう。興味深いことに,マウスの生殖細胞を対象とした以前の研究では,L-リジンやトリチウムヌクレオシドなどの一部の有機結合トリチウムは,HTO52のようなトリチウムよりも効率的に優性致死変異を誘発することが示されており,TAAの腸内における特異的な標的を特定するという我々の仮説を支持するものである。

 

上記に加えて、被曝期間を延長した場合の影響を調べることは興味深い。というのも、本研究で採用した8カ月間の曝露に2カ月間の開始年齢を加えた10カ月間は、マウスモデルの寿命よりもはるかに短いからである。一方、人間の場合は、原子力発電所の周辺に住む人々のように、数年から数十年にわたって被曝する可能性がある。さらに、EPOやFlt3-Lの濃度、血漿中のヘプシジンやフェリチン、肝臓や腸内の鉄分など、いくつかのパラメータについては、1ヶ月間の被曝後よりも8ヶ月間の被曝後の方が個人差が大きいことがわかった。また、肝臓や腸内の鉄分やフェリチン濃度など、いくつかのパラメータに曝露期間の影響が見られた。したがって、トリチウムにさらされた期間が長ければ長いほど、鉄代謝や他の生理学的システムに対する影響は大きくなるか、あるいは異なるものになる可能性がある。

今回の結果は、飲料水のトリチウム濃度に関する現行の規制を裏付けるものである2,4。この研究で使用したトリチウムの最低濃度である10 kBq.l-1は、WHOの勧告レベルに相当する。この濃度では、HTOによる生物学的影響は観察されなかった。また、100倍の濃度でもHTO摂取による影響はほとんど見られなかった。したがって、10 kBq.l-1という推奨レベルは、HTOに対して十分な防護効果があると考えられる。TAAについては、状況はやや異なる。実際、10 kBq.l-1では限定的ではあるが有意な生物学的影響が観察され、1 MBq.l-1ではより大きな振幅の生物学的影響が観察され、明確な線量反応が見られた。しかし、食品に含まれる有機結合トリチウム核種の割合が低く、飲料水にもほとんど含まれていないことから、曝露の可能性は低いと考えられる。ほとんどの場合、有機結合トリチウム型のトリチウムは、動植物に含まれる全トリチウムの30%未満であるが8,飲料水には1%未満である。さらに、本研究で使用した3種類のTAAは、全有機結合トリチウム体の0.1%未満であり、おそらくそれよりもはるかに少ないと思われる。したがって、飲料水に含まれるTAAは、飲料水に含まれるトリチウムの全化学形態の0.001%よりもはるかに少ない可能性がある。つまり、10kBq.l-1のTAA濃度は、1000GBq.l-1未満のトリチウム全体の濃度に相当するはずである。今回の研究では、20 MBq.l-1のHTO濃度による影響は限定的なものであり、同じモデルを用いた他の研究でも同様の結果が得られていることから 26,43,45,53,規制濃度レベルのトリチウムの有機結合トリチウム体に起因する生物学的影響が飲料水に発生する可能性は極めて低いと考えられた。したがって、飲料水に含まれるトリチウムに関する現行の規制は、十分に保護されていると弁護できそうである。