健康的な脂肪と排除層の大きさ
Healthy fats and exclusion-zone size

強調オフ

水・EZウォーター脂質・細胞膜・コリン

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pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32066069/

Abha Sharma⁎, Gerald H. Pollack

ワシントン大学バイオエンジニアリング学部、シアトル、98195、WA、アメリカ合衆国

キーワード 排除層水、油脂、ギー、ココナッツオイル、ラード、UV-VIS 分光法健康増進機能、EZウォーター、EZ水

概要

排除層(EZ)と呼ばれる第4の水相は、親水性表面から広がっている。その特徴は、こや分子の溶質を排除し、270 nmで特徴的な吸光度を示すことである。細胞内では、膜、高分子、細胞内小器官との界面にEZ水が存在し、その集積が機能発現に重要であると考えられている。

健康維持に役立つと考えられてきた脂質は、ここ数十年の間に悪い評判が広まっている。健康における脂肪の正確な役割はまだ不明であるが、現在ではより受け入れられている。

私たちは、いくつかの油脂について、EZ水を発生させる能力をテストした。ギー、ココナッツオイル、ラード、有機澄ましバター、Brain Octane®オイルの表面には大きなEZが形成された。冷たいギーは特に大きなEZを形成した。

このように、EZの成長は、マイクロスフィア排除法および脂肪を挟んだ試料のUV-VIS吸光光度法によって確認され、細胞の水分補給における重要な因子であり、脂肪の健康増進機能の根底にある可能性が十分にあることがわかった。

1. はじめに

水は細胞内に最も多く存在する分子であり、細胞全体の約70%を占めている。また、細胞には小器官があり、核酸、タンパク質、脂質、糖質などの様々な高分子が細胞膜の中にしっかりと詰まっている。このため、細胞内の水分子の多くは親水性表面から数ナノメートルの距離にある。したがって、細胞内の水は主に界面に存在することになる。この特徴は、細胞機能にとって大きな意味を持つ可能性がある(Pollack, 2001)。私たちは、この水を「排除層」(EZ)水、あるいは「第4相」水と呼んでいる(Pollack, 2013)。ゲルや生体表面などの親水性表面の隣に広く存在し、溶質を排除するという特徴を持つEZ水は、細胞の健康と機能にとって不可欠であることが示されている(Pollack, 2001)。一方、EZ水からバルク水へのシフトは、多くの細胞や生理作用の誤作動を引き起こす重要な要因であることが示されている(Pollack, 2013)。

EZ水が細胞機能に重要であることから、健康を促進することが知られている物質は、EZ水を構築することによってその効果を仲介し、それによって細胞を潤し、細胞機能を正常化し、健康を回復させることができるともっともらしく仮定した。このようなメカニズムで、健康を促進する物質があると考えられるのだ。

かつては健康にとって忌み嫌われる存在であった脂肪が、現在では健康にとって重要であることが広く認識されている(Sserunjogi, Abrahamsen, & Narvhus, 1998; Zevenbergen et al.) 様々な脂肪の中でも、ギーは伝統的に食品、医薬品、および多くの有益な特性を有する最も健康的な食用脂肪源と考えられている(Sharma, Zhang, & Dwivedi,2010; Sserunjogi et al, 1998; Sud & Kateriya, 2015; Tirtha,1998)。また、ギーは清澄化バターの一般的なインド名である(Sserunjogi et al.、1998)。同様に、飽和脂肪としてココナッツオイルが普及しつつある一方で(Gopala Krishna, Raj, Bhatnagar, Prasanth Kumar, & Chandrashekar, 2010; Marina, Che Man, & Nazimah, 2009)、ラードは過去に広く用いられてきた(Li et al, 2017)。

そこで私たちは、高度精製ココナッツオイル(Brain Octane®)由来のカプリル酸トリグリセリドを含むこれらと関連する脂肪がEZ水を構築するかどうかを判断したいと考えた。もしそうであれば、クラスとして、健康構築物質(Sharmaら、2018)は、EZ水の構築を通じてその効果を媒介し得るという仮説を支持することになる。

私たちは、EZサイズを測定するための標準的なアプローチを使用した(Sharmaら、2018;Zheng、Chin、Khijniak、&Pollack. 2006)。これには、水性微小球懸濁液に浸漬されたNafionなどのEZ核形成表面が含まれる。EZは、Nafionに隣接し、浮遊する微小球が排除される領域と定義される。今回の実験では、ナフィオンを油脂製のシリンダーに置き換え、シリンダー周辺の排除層の大きさを調べた。これは、油脂の表面にEZが存在することを示した最初の研究である。

2. 材料と方法

2.1 . マイクロスフィア懸濁液 EZのサイズを決定するために使用した懸濁液は、ポリカルボキシレートコートした2μmのマイクロスフィア(Polysciences Inc; # 18327;

2.5% solids-latex, Warrington, PA, US)またはポリスチレンコート2 μm microspheres(Polysciences Inc; # 19814; 2.5% solids-latex, Warrington, PA, US)をそれぞれ含有したものである。これらを脱イオン水(DI)に懸濁させた。

(DI) 水に懸濁させた。マイクロスフィアとDI水の体積比を一定(1:300)に保ち、濃度差から生じる可能性のある影響を排除した。

2.2. 油脂

私たちは、室温(RT)で固体である4種類の油脂を研究した。すなわち、ブレットプルーフ(BP)ギー(グラスフェッド)(米国ワシントン州シアトル);ドクターブロナーのマジック「オールワン」フェアトレード、および有機バージンココナッツオイル(VCO-生絞り、未精製、「ホールカーネル」)(オーストラリア、ビクトリア);テンダーグラスファームズ有機ラード(米国バージニア州フロイド);およびAlbertsons Companies(米国アイダホ州ボイシ)のO Organics®スイートクリームバター(無塩);である。さらに、室温で液体のBulletproof “Brain Octane®” oil (Bellevue, WA, USA) (高度精製ココナッツオイルからのカプリル酸トリグリセリド)についても調査した。

2.3. 油脂シリンダー

各脂肪(ギー、ココナッツオイル、ラード)を清潔なヘラで容器から少量すくい取り、15 mLポリプロピレン試験管に入れた。試験管を沸騰水槽で、5~10 分間加熱した後、液体脂肪を1.0 mL シリンジに注入し、-20℃の冷凍庫で、20~30 分間固化させた。注射器の内容物を開口部(針なし)から 35 mm ペトリ皿上に注意深く吐き出して小さな円筒(長さ 3 ~ 8 mm、直径約 1 mm)を作り、冷蔵庫(4℃)で、20 ~ 30 分間静置した。このサンプルを「コールドファットシリンダー」と名付けた。一方、室温で、1.0 mL シリンジ内で固化(約 1 時間以下)した油脂から作られたシリンダーを「室温(RT)シリンダー」と呼ぶことにした。

2.4. オーガニックバター

15 mLのポリプロピレン製試験管を沸騰水槽に入れ、少量のバターを溶かした。脂肪シリンダーと同様に、液体脂肪の一部を1.0 mL シリンジに注ぎ、冷凍庫で、20~30 分間固化させた。これをオーガニックバター(Org B)とラベル付けした。液体有機バターの第二の部分を、570×gで30分間遠心分離した。均質な混合物は2つの部分に分離した。白い乳固形物を含む下部の部分は廃棄された。上澄み液は、清澄バターまたはオーガニックギーを構成し、新しいポリプロピレンチューブにピペッティングされ、「オーガニック清澄バター」(Org CB)とラベル付けされた。Org CBから、上記と同様の方法で円筒を作製した。

2.5. ブレットプルーフ・ブレインオクタン油

Brain Octane油(BO)をニトロセルロース(NC)膜(Bio-rad社製)から切り出した短冊(幅1 mm、長さ4~5 mm)に含浸させた。

0.45 µm pore size)またはWhatman Grade 42 ashless filter paper, (2.5 µm pore size)から切り出した短冊に含浸させ、それぞれ4時間または2時間、蓋付きシャーレの中に置いた。同様のサイズのストリップに純水を含浸させた(コントロール)。含浸させたストリップ(BOまたはDI)をキムワイプに穏やかにブロットし、ペトリ皿中のポリカルボキシレートコートした2μm微小球懸濁液3.0 mLに入れ、以下に脂肪円柱について述べるようにEZ測定に使用した。

2.6. EZの測定セットアップ

35  mm × 10 mmのFalcon® ポリスチレン製シャーレに調製した微小球懸濁液 3 ~ 4 mLを入れ、ファットシリンダーを浸漬させた

このディッシュに蓋をし、2.5x対物レンズを装着したZeiss Axiovert 35顕微鏡のステージに設置した。コンピュータにダウンロードしたAmscopeソフトウェアを自動画像にセットアップし、脂肪円筒に対して形成されるEZの画像を撮影した。EZの測定はすべて1分間隔で行い、20分間継続した。Image J (imagej.nih.gov/nih-image/)のグラフツールを使用して、円柱の片側で3回測定し、そこから平均EZサイズを求めた。

2.7. ギーの親水性

親水性の程度を測定するために、実験室の照明と22〜23℃の温度という標準的な条件下で、ギー表面の水滴の接触角(θ°)を測定した。

35 mm×10 mmのファルコン®ポリスチレンシャーレ上に液体ギー(0.2 mm厚)を薄く積層して固化させた後,純水(滴下量-50 µl)をピペットでセット面に滴下した。水滴は5分間安定させ、最終的な静止状態とした。水滴と固体ギー表面の間の接触角(Kowk-Yee & Zhao, 2015)を、ギー表面の上にある水滴の水平軸に沿って焦点を合わせるように適切に調整した解剖顕微鏡の二重対物レンズ(倍率0.7〜4.5x)を通して三次元視覚として観察した。

追加の照明は、光ファイバー顕微鏡の照明器(Amscope冷光源ハロゲンランプ150 W、Irvine、CA、USA)に取り付けられた、簡単に操作できる2本の光ファイバーグースネックライトケーブルによって提供された。内蔵ビデオカメラが拡大画像を撮影し、付属の高解像度モニターに表示・保存して飛沫プロファイル/角度解析を行った。

2.8. ギーシリンダーを取り囲む水のUV-Vis分光法

排除層(EZ)水のUV-VIS吸収スペクトルは、270 nmに特徴的な吸収ピークがあることで明確に定義される。ギー周辺の微小球のない領域が本当にEZ水であるかどうかを調べるために、見かけ上のEZから液体を抽出し、分光学的に検査した。35 mm×10 mmのファルコン®ポリスチレンシャーレに、3 mLの純水(マイクロスフェアーを含まない)に円柱状のギー(Ghee)を入れた。このシャーレに蓋をして、2.5倍の対物レンズを装着したZeiss Axiovert 35顕微鏡のステージに置いた。顕微鏡のランプライトは10~20分間 “on “の位置にセットした。

10分後に1mLツベルクリン注射器と27G×1/2″BD PrecisionGlide針を用いてギーシリンダー近傍のEZ水を抜き取り、UV-可視吸光分光分析用にあらかじめラベルを付けたチューブに堆積させた。

シリンダーに隣接するEZ水を抽出することが困難なため、同じ手法を若干変更したものを使用して界面EZ水も収集した。65mmシャーレに直径3~4cmのペレット円として液体ギーを重ね、冷蔵庫(4℃)で20~30分静置した。純水はギーペレットから0.8〜1mm上になるように慎重に加えた。10分後、重ね合わせた水をピペットチップで注意深く吸引し、200~350 nmの紫外可視波長域で分光測定を行った。

2.9. 統計解析データは、N(実験数)の平均値±SDで示した。異なるグループ間の統計的有意性は、Students t testを用いて決定した。p値<0.05を有意とした

3. 結果

3.1. 異なる油脂の円柱の周りに形成されたEZ

図 1は、コールドギー、ココナッツオイル、ラード、有機澄ましバター(Org CB)の円筒に対して形成されたEZの代表的な画像である。マイクロスフェアフリーゾーンは、両頭矢印で示されており、異なる円筒の周りに様々な大きさのEZがあることを示している。有機バター (Org B)の円筒に対してはEZは見られない。

図1 異なる油脂の円筒の周囲に形成された水の排除層(EZ)

2μmのポリカルボキシレート微小球の水性懸濁液中の脂肪円筒に対して形成された代表的なEZ(両頭矢印で示す)。


脂肪円筒(コールドギー、ココナッツオイル、ラード)に対して、最初の時間帯は着実にEZが形成され、その後、10分後にはわずかに減少することがわかった。これらの結果は、最初の10分間でEZのサイズが著しく増加したNafion(Pollack, 2013)で観察された結果と類似している(図2)。10分後のEZは、コールドギー(789 ± 220 µm)とココナッツオイル(764 ± 230 µm)で最も大きく、ラード(585 ± 36 µm)で形成されたものよりも20~25%大きかった(p値≤ 0.05)。一方、Org Bで作った円筒の隣のEZは55〜100μmしかなく(しかも一部でしか観察されず)、Org Bを遠心分離して得た澄ましバター(Org CB)の円筒の隣のものは10分で6倍近くも大きくなった(p値≦0.01)。

3.2. 異なる条件で調合したギーのシリンダー周辺におけるEZの形成

EZの形成は、ギーのシリンダーが形成された条件によって異なる。全体として、冷たい環境(冷たいギーシリンダー)は、暖かい環境よりも大きなEZを誘発した(図3)。2μmのポリスチレンコーティング微小球、2μmのポリカルボキシレートコーティング微小球のいずれを使用しても、同様の結果が得られた。また、10分後のEZは、室温で調製した円柱状のギーに対して形成されるEZの約2倍であった(p値≦0.01)。

図2 ココナッツオイル(VCO)、ラード、ギー(Cold ghee)、有機バター(Org B)、有機澄ましバター(Org CB)のシリンダーに対して形成されるEZの時間経過

各点は標準偏差を持つ平均を表す N(実験数)。各10-12個。


図3 室温(RT ghee)および低温(Cold ghee)で調合したギーの円筒に対して形成されるEZの時間経過

各点は、標準偏差N(実験数)を持つ平均を表す。室温(RT)およびCold gheeについて、それぞれ12個ずつ。


 

3.3. Brain oil®を含浸させたストリップに対するEZの形成

「ブレインオイル」は室温(RT)では液体であるため、シリンダーを形成することができなかった。そこで、ニトロセルロース膜(NC)またはワットマングレード42(W42)ペーパーにBrain oilを含浸させ、対照として純水を使用した。時間経過の研究から、EZはどちらの場合にも存在し(図4aおよびb)、いずれの場合も、DI水の対照と比較して「ブレインオイル」を含浸させたストリップで大幅に大きくなっていることが示された。

3.4. ギー(Ghee)の親水性

ギーは親水性を示し(図5:θ<90°)、水滴が形成する接触角は当初68°±6°であったが、徐々に減少し、5分後には50°±6°に広がった(N(ex periments number of experiment): 4).

3.5. EZ水のUV-Vis分光測定

ギー円筒のすぐ近くから採取したサンプルでは、10分後の現像で260〜300nmの間に幅広い吸光ピークが観測された(図6a)。より顕著なのは、同じ時間後にギーペレットの上部から採取した界面EZ水サンプルで、280 nm付近に鋭いピークを示したことである(図6b)。

4. 考察

脂肪は、ほぼ毎日トップニュースで報道されている。カロリーを多く含むこれらの栄養素は、私たちの食生活に欠かすことのできないものであるが、議論のあるところである。脂肪は健康によいのか、どの脂肪が健康によくてどの脂肪がよくないのか、すべての飽和脂肪酸が健康に悪いのか、といった疑問が生じるのだ。

脂肪は細胞膜の重要な構成要素である。脂肪は主要な代謝燃料として機能するだけでなく、熱的・電気的な絶縁や機械的な保護も提供する。さらに、多価不飽和脂肪酸は、脂質ベースの細胞シグナル伝達システムと遺伝子制御に関与している。(Rustan & Drevon, 2005)。脂肪の人気に関する大きな論点は、食事脂肪とその構成脂肪酸の違い、化学的性質(飽和および不飽和含有量)、およびヒトでの代謝に関する知識の欠如から生じている。時を経て、これらの側面は現在では文書化され、一般的な健康、幸福、疾病に重要な役割を果たしている(Rustan & Drevon, 2005)。

図4 (a) ニトロセルロース(NC)ストリップと(b) Whatman Grade 42(W42)紙ストリップに対して形成されるEZの時間経過

ストリップは、Brain oil(BO)またはDI(脱イオン水)に含浸させた。各ポイントは、標準偏差N(実験数)を持つ平均を表す。それぞれ10点ずつ。

しかし近年、飽和脂肪酸は不健康であり、避けるべきであるという数十年のドグマが見直されつつある。実際、いくつかの飽和脂肪酸は復活しつつある。ある文化圏では、ギーは人間が食べるのに最も適した脂肪源として挙げられている(Tirtha, 1998)。私たちは、ギーがEZ水を作ることができるかどうかをテストしたかったのであるが、テストしたところ、大きなEZが観察された。実際、ギーで形成されたEZは、標準的な材料であるナフィオンで形成されたEZよりも大きく、ギーがEZを核形成する能力において最高級であることを示唆している。

さらに、ココナッツオイル、ラード、スイートクリームバターなど、料理によく使われる油脂についても、EZを形成する能力について調査した。ギーによって形成されたものと同様のEZが観察され、健康を促進するいくつかの栄養補助食品およびいくつかの一般的な鎮痛薬の生理学的用量は、細胞内にEZ水を構築することによってその効果を媒介し、それによって機能と健康を高めることができるという私たちの以前の発見(Sharmaら、2018)を立証している。

化学的には、脂肪はトリアシルグリセロール(TAG)の複雑な多結晶多成分混合物である(Himawan、Starov、&Stapley. 2006)。各TAGはグリセロール骨格に3つのエステル化脂肪酸部位を持ち、その鎖長(炭素数4から22の範囲)と飽和度が異なる場合がある。一般的に、飽和脂肪酸を有するTAGは、短鎖および/または不飽和脂肪酸を主成分とするトリグリセリドを有するTAGよりも融点が高くなる。TAG組成は、脂肪の結晶化および多形特性にも影響を与え得る(Ramel、Co、Acevedo、およびMarangoni. 2016)。

これらの要因の考察は本研究の範囲外であるが、私たちは、これらの要因がEZの親水性に影響を与えると推測している(Zhengら 2006)。粒子や分子を除く以外にも、EZ水は水よりも粘性が高く、アルカリ性で密度が高く(Hwang, Hong, Sharma, Pollack, & Bahng, 2018; Pollack, 2013)、サイズは数十から数百マイクロメートルである。私たちは、ギーとココナッツオイルで極めて大きなEZを観察した(図2)。また、牛乳クリームから得られる清澄化ギーという自家製製剤でも同様の知見(結果は未掲載)が得られた。ギーは清澄化されたバターであることから、有機スイートクリームバターを溶かし、乳固形分を除去して清澄化したものでのEZ形成も検討した。溶融した上澄み液(清澄バター)を注射器に入れ、固化させた(Org CB)。予想通り、Org CBシリンダーに対してEZが形成され(474±71μm)、Org Bシリンダーに対して形成されたものよりも有意に大きかった。

図5 水滴と固体ギー表面の接触角(θ°)を決定するための代表的な水滴形状プロファイル解析

【原図参照】

脂肪円筒(コールドギー、VCO、ラード)に対するEZ形成の動力学は、ナフィオンで観察されたものと類似していた(Zheng et al. 2006)。EZは初期の時間帯に安定して蓄積されたが、その後、10分後にはわずかに減少した(図2)。さらに、室温のギーシリンダーで形成されたものと比較して、冷えたギー表面で測定した場合は約2倍になった(図3)。この違いは、水と微小球を含む小さな部屋に熱伝導性材料の舌を挿入し、その後冷却した、私たちの以前の観察(Pollack, 2013)と類似している。基本的に、ギーは冷たい表面によって、シャーレ内の隣接する水から赤外線エネルギー(熱)を引き出していたのである。大量の水から冷たいギーに移行する際、エネルギーは排除層を通過し、成長を助けるのだ。

ニトロセルロース膜またはWhatman Grade 42から切り出したブレインオクタンオイルを注入したストリップは、純水を入れたそれぞれのコントロールに比べて少なくとも2~5倍大きいEZを形成した(図4)。このように、ブレインオイルは健康的な脂肪の供給源となる可能性がある。

図6 (a) ギーシリンダー近傍(実験回数;N:8回) (b) ギーペレット上面(実験回数;N:10回)から吸い上げた DIの代表的な吸収スペクトル

原文参照

一方、ギーシリンダー脂肪の近傍のEZ水サンプルは水中にある。ギーの場合、飽和脂肪が組成のほぼ65%を占め、不飽和脂肪は20-25%を占めている(Mehta, 2013)。ギーの上にある水滴が作る接触角は50~55°であり(図5)、広い面積に広がることが可能な濡れ面であることが示唆された。また、マイクロスフェアーを除去した円柱状のギーに対して、連続してEZが形成されたこと、さらに脱イオン水に一晩浸漬されたことから、水分に富んだ親水性表面が存在することが確認された。

のUV-VIS吸光度ピークはブロードであったが(図6a)、水中の冷たいギーペレットの上面から採取したサンプルのスペクトルでは、270nmと280nmの間にシャープな吸収ピークが発生していた(図6b)。このピークはEZ水に特徴的である(Pollack, 2013; Zheng et al. 2006)。EZ吸光度に関する同様の知見は、標準的なNafion®ポリマー膜との反復接触後の水サンプル(Elia et al., 2013)およびQELBY®懸濁液から得られた上清(Sharma, Toso, Kung, Bahng, & Pollack, 2017)でも報告されており、EZ水の存在を強く示唆している。

したがって、ギーやココナッツオイルなどの飽和脂肪は、大きなEZを構築し、全体的な文脈で観察すると健康的と見なされるかもしれない。同様の結論は、生化学的および他の分析手法を使用する研究者によって導き出されている(Boateng, Ansong, Owusu, & Steiner-Asiedu, 2016; Hosseini & Asgary, 2012; Lee et al, 2018; Mirzaei, Khazaei, Komaki, Amiri, & Jalili, 2018; Mohammadifard et al, 2010)。実際、EZを形成する能力は、健康的な脂肪を選択するための重要な基準である可能性がある。

5. 結論

大きなEZ(最大800μm)が、ギー、ココナッツオイル、ラードなどの飽和脂肪の核表面に対して形成された。ナフィオンと同様の時間経過で形成されたギーのEZは、270nm付近に特徴的な吸光度を有していた。これらの知見は、健康を促進する薬剤もEZを構築することを実証した私たちの既報の結果(Sharmaら、2018)にさらなる裏付けを与えるものである。

利害関係者の宣言

著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる既知の競合する金銭的利益または個人的関係がないことを宣言する。

謝辞

私たちは、防弾少年団から提供された贈り物と、ソフトウェアAG(SAGST)財団(賞番号:CS-P 12665、ドイツ)からの資金提供に感謝する。また、Zheng Li、Kurt Kung、Iman Rad、Rainier Stahlberg、Rajendra Sharmaとの有益な科学的議論に感謝する。Gita Bhatnagarより予備実験用に牛と水牛のミルククリームから作られた自家製ギーが贈られたことに感謝する。

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