起源不明の慢性腎臓病の原因としてのグリホサートの他の要因との相乗毒性

強調オフ

GMO、農薬グリホサート

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Glyphosate’s Synergistic Toxicity in Combination with Other Factors as a Cause of Chronic Kidney Disease of Unknown Origin

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6695815/

要旨

原因不明の慢性腎臓病(CKDu)は世界的なパンデミック病である。スリランカでは、1990年代半ばにノースセントラル州で初めて確認されて以来、4~5年ごとに2倍に増加している。この病気は主に農業地域の人々が罹患しており、一般的に知られているCKDの危険因子を欠いている。スリランカだけではなく、メキシコ、ニカラグア、エルサルバドル、インドのアンドラプラデシュ州でもCKDuの有病率が報告されている。

CKDuの原因を世界的に調査しても、単一の要因ではなく、むしろ多くの要因がCKDuの病因に寄与していると考えられている。これらの要因のいくつかは、脱水症状をもたらす熱中症、カドミウムやヒ素などの有毒金属、フッ化物、低セレン、毒性のあるシアノバクテリア、栄養不足の食事、カビ曝露によるマイコトキシンなどである。

さらに、農薬、特にグリホサートとパラコートへの曝露が複合的な要因となっている可能性があり、これが主な要因となっている可能性がある。ここでは、特にグリホサートが他のほとんどの要因と相乗的に作用して毒性効果を増大させていることを論じている。

我々はさらに、グリホサートがグリシンのアミノ酸アナログとしての作用を通じて陰湿な害を引き起こし、これが他の暴露に対する自然保護メカニズムを妨害することを提案する。グリホサートの相乗的な健康影響は、他の汚染物質、特にパラコートへの曝露や、低地熱帯地域のどこにでもある高温下での肉体労働と組み合わされて、スリランカではCKDuと同様の腎障害を引き起こす可能性がある。

キーワード

CKDu、腎臓、グリホサート、パラクワ、農薬、グリシン、脱水症
行ってみてほしい。

1. はじめに

1990年代初頭から、スリランカの北中部州で、主に若い男性を中心とした水田農業者の間で慢性腎臓病(CKD)のパンデミックが発見された [1、2]。現在、この病気は総人口15万人以上に影響を及ぼし、年間推定死亡者数は5、000人で、4~5年ごとに倍増していると推定されている[3]。このCKDの最大の特徴は、糖尿病、高血圧、糸球体腎炎などの一般的に知られている危険因子を病因としていないことである。このため、原因不明の慢性腎臓病または病因不明の慢性腎臓病(CKDu)と呼ばれることが多い。CKDuの有病率は、スリランカのいくつかの地区で15.1~22.9%です[4]。同様のCKDuのパンデミックは、主にメキシコと中央アメリカの太平洋沿岸のサトウキビ労働者の間で報告されている(メソアメリカ型腎症)、インドのアンドラプラデシュ州の農業労働者の間で報告されている(ウッダナム型腎症)。エルサルバドルでは、2007年から 2017年にかけて30.6%増加し、死因の第2位となっている[5]。この病気の影響を受けている他の国には、グアテマラ、コスタリカ、ホンジュラス、エジプトなどがある[6、7]。

世界保健機関(WHO)を含むいくつかの研究者や組織は、スリランカにおけるCKDuの原因をピンポイントで特定するための研究を行ってきた。しかし、これらの研究はいずれも決定的な結果は得られなかった。本論文の目的は、スリランカのCKDuに関連する原因因子に関する現在の文献をレビューし、これらの知見を一つのモデルに統合して、我々の知識の現状に即してCKDuの病因を説明できるようにすることである。また、CKDuやその他の健康への悪影響の発症に関与する生化学的機序についても議論する。

最近の研究では、メソアメリカ型腎症(MeN)とスリランカ型農業腎症(CKDu)との臨床的・病理組織学的比較が試みられている。MeNはCKDuと同様に病因が不明である。慢性間質性腎炎と糸球体硬化症は、両タイプのCKDにおいて最も一般的な病理学的所見である[8]。これらのタイプの病理学的変化は、ほとんどの場合、職業的および/または環境曝露で明らかになる。同様の所見は、鉛、カドミウム、およびアリストロキチン酸への過度の暴露に続いて報告されている[9]。除草剤のグリホサートは、スリランカにおけるMeN [10]とCKDu [11、12]の両方の主要因子として関与している。エルサルバドルとスリランカの両方から採取した腎生検では、毒性腎症と一致する病理学的画像が見られた [9]。より最近の研究では、Wijkströmら(2018)[13]は、スリランカのCKDu患者の形態学的および生化学的特徴が中米のMeNパンデミックと多くの類似点を有しており、類似した診断主体およびおそらく類似した病因を示唆していることを発見した。慢性間質性腎炎と糸球体硬化症のこれらの病理学的所見がかなり一致していることから、スリランカのCKDuは中毒性腎症であることは十分に一致している [11、14、15、16、17、18、19]。しかし、どのような職業的曝露と環境毒物の組み合わせがCKDuに現れるのかについては、研究者間ではあまり一致していない。

この論文では、スリランカにおけるCKDuは、パラコート、過度のフッ化物およびリン酸塩への曝露、重金属、界面活性剤、病原性毒素など、多くの異なる毒性物質との組み合わせによるグリホサートの相乗的毒性の結果であり、脱水症状を伴うものであるという仮説を展開する。グリホサートをベースにした製剤は、単独でのグリホサートよりもはるかに毒性が高いと論じられてきた[20]。製剤にはポリオキシエチレンアミン(POEA)や第四級アンモニウム化合物(QAC)などの添加物が含まれており、これらはグリホセート自体よりもかなり急性毒性が高いことが毒性試験で示されている。彼らはまた、既知の腎毒性物質であるヒ素、クロム、鉛、ニッケルなどの有毒金属を製剤中から検出した。

グリホサートは人間には比較的無毒であると広く信じられていたが、最近の証拠はその認識を劇的に変えた。国際がん研究機関(IARC)は2015年3月にグリホサートを「可能性のある発がん性物質」と表示し、カリフォルニア州もこれに追随して表示が必要な「可能性のある発がん性物質」としてリストアップした。2018年8月から 2019年6月までの1年足らずの間に、グリホサートと非ホジキンリンパ腫との因果関係をめぐるカリフォルニア州の3件の訴訟が成功し、20億ドルを超える陪審員賞を獲得した。バイエルはこれらの訴訟が起こされる少し前にモンサント社を買収していたため、この結果、バイエルの株式価値が大幅に下落した。2019年7月、オーストリアは、グリホサートをすべての用途で禁止する欧州初の国となった[21]。

我々はここで、グリホサートは、添加された配合剤がなくても、タンパク質合成中にコード化アミノ酸グリシンを誤って置換することを伴う、独特の陰湿な毒性のメカニズムを持っていることを論じている。これは、他の環境化学物質の解毒や除去に重要なタンパク質の破壊につながり、他の環境化学物質がそうでない場合よりもはるかに多くの腎毒性を引き起こすことになる。グリホサート、パラコート、脱水症状が結びついた腎症は、農業従事者の間で起こっているこの世界的な健康危機について、今後の研究の道筋を示している。

2. 病因不明の慢性腎臓病患者の環境条件

CKDuの発生は過去30年間に限られており、ほぼ常に農業コミュニティで発生していることを考えると、農業と気候変動に関連した人間活動の結果である可能性が高い。一部の研究者は、この病気を農業コミュニティにおける慢性間質性腎炎(Chronic Interstitial Nephritis in Agricultural Communities)またはCINAC(シナック)と呼ぶことで、農業の要素を強調している[22]。それにもかかわらず、この疾患は、暑くなりつつある高温気候に住む人々の腎臓の近位腎尿細管を標的としている [23] 、汚染が進んでいる [24、25]。

農業地域における複数の毒素の蓄積の結果として考えられるのは、CKDuの風土病地域の子供たちにも初期の腎障害が現れているという観察である[26]。複数の研究で一貫して確認されているCKDuの危険因子には、男性の性、農家であること、適切な個人防護具(PPE)を使用せずに農薬を使用および/または散布していること、自宅または畑で井戸水を飲むこと、および腎機能障害のある家族を持つことが含まれる [27、28、29、30]。貧困、教育の欠如、不十分な医療処置、および安全な飲料水へのアクセスが制限されているか、または全くないことも、寄与因子の集合体として同定されている [31]。多くの著者は多因子による病因を示唆しているが [3、27、28、29]、スリランカのCKDuに寄与する可能性のある毒物の媒介物としての水田栽培用の飲料水と灌漑システムの役割に関する新たな証拠が蓄積され始めている [32、33]。CKDuの影響を受けた地域のほとんどの水田は、古代のカスケード式のタンク式灌漑システムによって灌漑されている。Abeysinghaらは、カスケード灌漑システムの設計と、CKDuの風土病地域での新しい商業的な農法(主に農薬の使用)の導入に伴う生態系への有害な変化が、CKDuの急速な蔓延にどのように寄与したかについて詳細な説明を行っている[34]。

CKDu被災地で200人の参加者にインタビューを行った人類学的調査によると、農業集落の94%、古い村落の86%、ヴェッダ(先住民族)の80%が腎臓病を井戸や管井からの汚染水の飲用が原因であると考えていることが明らかになった[35]。これらの村人の印象は、CKDuの負担が最も高い地域に住む子供たちの早期腎障害の発見によって科学的に確認された[26]。Jayasekeraらは、新たに出現したCKDuの病巣が貯水池や運河の水位以下の村にあることを示している。これは、灌漑水が飲料水の主要な供給源である家庭の浅い井戸に排水されている可能性を示していると考えられる[1、32]。

複数の研究では、かつて農民の飲料水源として利用されていた灌漑用水貯水池や浅い井戸に含まれるカルシウム、マグネシウム、フッ化物、その他ヒ素、カドミウム、鉄、鉛、アルミニウムなどの重金属の含有量が分析されている[36、37、38]。これらの井戸のほとんどは、受け入れがたいカビ臭い味(村人たちは「キヴル」と表現している)がするため、現在では放棄されている。Jayasumanaらは、井戸水を飲むことと、放棄された井戸から水を飲んだことがCKDuの重要な危険因子であることを示している(オッズ比2.52、(95%CI 1.12-5.70)および5.43、(95%CI 2.88-10.26)である)[33]。同研究では、放棄された井戸の 94%が 1μg/L 以上のグリホサートを含有していたのに対し、現在使用されている井戸の 31%が 1μg/L 以上のグリホサートを含有していたことが示されている。彼らはまた、グリホサートを散布した被験者は、そのような履歴のない被験者と比較して、CKDuを発症する可能性が4倍高いことを報告した。

井戸水中のグリホサートについて試験した他の研究は、世界保健機関(WHO)が実施した研究のみであった[36]。グリホサートに加えて、このWHOの研究では、カドミウム(既知の腎毒性金属)、ヒ素、鉛に加えて、低レベルの(枯渇した)セレンが検出された。研究はまた、被験者の65%がグリホサートを尿中に排泄し、別の28%がその代謝物であるアミノメチルホスホン酸(AMPA)を排泄したことを報告した。著者らは、”重金属と腎毒性のある農薬への同時曝露がCKDuの発症と進行の一因になっている可能性がある “と述べている。飲料水に含まれるこれらの重金属の主な供給源は、これらの金属で汚染された肥料からであることが実証されている[39]。汚染された肥料の豊富な使用に加えて、スリランカは農薬の使用率が最も高い国の一つであり、アジアで4位である[40]。

スリランカの農薬登録機関に勤務する同じ著者によると、野菜サンプルの33%が残留農薬で汚染されていた。これらの農薬には、ジアジノン、フェントエート、プロチオフォス、オキシフルーフェン、テブコナゾール、そしてすでに禁止されているクロルピリホスが含まれていた。興味深いのは、この同じ研究では、グリホサートの残留農薬を検査していないことである[40]。

別の最近の研究では、CKDuの影響を受けた地域でのグリホサート汚染が示されている[41]。グリホサートはすべての堆積物サンプル(85~1000μg/kg)から検出され、有機物含有量と強い線形関係が観察された。表土中に Fe3+やAl3+などの高原子価陽イオンが存在すると、グリホサートと金属の複合体が形成され、結果として土壌中にグリホサートが強く保持された。降雨も曝露の潜在的な原因の一つである。アルゼンチンで行われた研究では、採取した雨のサンプルの 80%で最大 67 μg/kg のグリホサートが検出された [42]。

CKDuの影響を受けた地域の個人は、赤レンズ豆などの輸入食品だけでなく、地元で栽培された食品の消費によっても、より多くのグリホサートを摂取している可能性がある。2016年国勢調査統計局の家計調査によると、赤レンズ豆の平均消費量は1人1ヶ月あたり583.40gと推定されている。赤レンズ豆は、米とほぼ同じようにスリランカの食生活の主食となっている。オーストラリアとカナダは、スリランカへの赤レンズ豆の重要な供給国となっている[43]。カナダ食品検査局(CFIA)が、カナダとオーストラリアの農家が栽培した赤レンズ豆とムングダルの多くのサンプルを対象に実施した試験では、グリホサートの含有量がそれぞれ10億あたり平均282部、10億あたり1000部であったが、これはどの基準から見ても高値である[44、45]。

過去10年間にスリランカで行われたCKDuに関する研究のほとんどは、複数の仮説を導き出している。これらの仮説には、CKDuの可能性のある原因として、ヒ素、カドミウム、腎毒性のある農薬、フッ化物、安価なアルミニウム製の容器の使用、シアノバクテリア、アーユルヴェーダ治療、ヘビに噛まれたこと、非ステロイド性抗炎症薬の使用などがある[36、46、47、48]。残念なことに、これらの仮説は互いに代替可能なものとして提示されたものであり、相乗的に作用する相補的な危険因子として提示されたものではない。これは機会を逸している。

我々の研究は、脱水と農薬曝露に関する既存の研究を基に、スリランカにおけるCKDuの病因を説明するために構築されている [49、50、51]。

気候変動は世界平均気温の大幅な上昇をもたらしており、今後さらに悪化すると予測されている[23]。これは、高温気候下で農業に従事する人々にとって、より多くの異常な暑さと暑さへの曝露を意味する。フロリダ州の農業労働者192人を対象とした最近の研究では、熱指数が5度上昇するごとに急性腎障害のオッズが37%上昇することが示された[52]。

スリランカの農業労働者は、過度の発汗を伴う極度の暑さと湿度の高い条件にさらされている。彼らの脱水状態は不明であるが、多くの政府および学術報告によると、彼らの井戸水が汚染されていることが示されている[24、37、49、53、54]。その結果、これらの農家では、通常の作業中にグリホサートやその他の農薬、カルシウム、マグネシウム、フッ化物、その他の重金属などを飲料水から多量に摂取している可能性がある[3、33]。以下に示すように、グリホサートと他の重金属および農薬の摂取は、グリホサートがチトクロームP450酵素[55]を阻害し、金属をキレートして腎臓に輸送する能力[12、56]の一部に起因して、CKDuの原因における重要な因子である可能性が高い。

3. CKDuの原因のウェブ

MacMahon and Pugh(1960)が最初に提案したように、CKDuを含む非伝染性疾患(NCD)には、その原因となる単一の因子は存在しない[57]。NCDの病因に寄与する因子は複数あり、それぞれの因子の役割をマッピングし、疾患負担への寄与度を測定することができる。これが疫学における帰属リスクの概念の起源であり、疾病負担を軽減するための介入を設計するためのプログラム計画にこの概念を用いることになった。これらの因果関係因子をマッピングすることで、因果関係の「ウェブ」という概念が生まれた。以下に、現在の知見をもとに、CKDuの因果関係のウェブを作成した(図1参照)。

図1

 

スリランカにおける病因不明の慢性腎臓病(CKDu)の因果関係のウェブ


この論文の残りの部分では、まず、グリホサートがタンパク質合成の際にグリシンを誤って代用する可能性があるという研究文献からの証拠を提示する。次に、1つ以上の原因因子がグリホサートと相乗的に作用して害を引き起こすことが予測されるCKDuのいくつかの側面について議論し、グリホサートがこれらの他の有害要素からの保護に関与する重要なタンパク質を破壊するためである。最後に、我々の知見を要約して締めくくりたいと思う。

4. グリシンアナログとしてのグリホサート

グリホサートはグリシンのアミノ酸アナログとして特徴づけられ、その毒性の多くはこの特徴に由来している可能性が高い。グリホサートは、クロロフィルとヘムの両方のコア成分であるポルフィリン環の合成の第一段階の触媒であるδ-アミノレブリン酸合成酵素など、グリシンを基質とする酵素を妨害することが実証されている[58]。グリシンは脳内の N-メチル D-アスパラギン酸(NMDA)受容体のリガンドであり、グリホサートは NMDA受容体を活性化して神経毒性を引き起こすことが示されている。グリホサートは、窒素原子が追加のメチルホスホニル基に結合していることを除けば、実際には完全なグリシン分子である。

ヒトに対するグリホサートの陰湿な累積毒性メカニズムは、タンパク質合成中にコーディングアミノ酸であるグリシンを置換するユニークな能力によって実現されているのではないかと提案されている[60]。多数の衰弱性慢性疾患の増加と主要作物へのグリホサートの使用との間に見られる強い相関関係を、このようなメカニズムを 通じて説明することが可能である[61、62]。様々な疾患にリンクされているタンパク質における強いグリシン依存性の詳細な説明は、糖尿病、肥満とアルツハイマー病[60]、筋萎縮性側索硬化症(ALS)[63]、自閉症、多発性硬化症とプリオン病[64]、無脳症[65]、CKDu[66]と痛風[67]のもっともらしい貢献の原因として、タンパク質合成時のグリシンのためのグリホサート置換に関連して、最近の論文のシーケンスで提示されている。

モンサントの研究者は、グリホサートがグリシン[68]の代わりに誤ってタンパク質に組み込まれていることを強力な証拠を提供する1989年に顕著な研究を行った。この研究では、ブルーギルサンフィッシュを放射性標識されたグリホサートに曝露し、組織内のグリホサート蓄積の指標として、放射性標識が存在するかどうかを様々な組織サンプルで調べた。その後、同じ組織サンプルのグリホサート濃度を測定するためにアッセイを使用したところ、放射性標識の20%までしかグリホサートとして説明できないことを発見した。しかし、組織サンプルをプロテイナーゼKによるタンパク質分解に付すことで、グリホサートの収量を最大70%まで増加させることができることを発見した。彼らはさらに、標準的なアッセイで検出できるようにグリホサートを解放し、ペプチド配列を個々のアミノ酸に分解するためにタンパク質分解が必要とされるため、収率の観察された増加を説明するために “タンパク質に組み込まれている “という言葉を使用していた。

タンパク質合成中のグリホサート置換については、シキメート経路における 5-エノールピルビルシキメート-3-リン酸(EPSP)合成酵素(EPSPS)のグリホサートによる抑制の特異的な側面に関する観察を通して、強力なケースを作ることができる。これがグリホサートの雑草に対する毒性の主なメカニズムであると考えられている。植物の複数の種と微生物の複数の種が、高濃度であってもグリホサートに対して完全に不感応である EPSPS の変異型を独自に獲得しており[63、69]、この変異はグリホサート耐性の中核作物における遺伝子操作の基礎を形成している[70]。いずれの場合も、突然変異は、基質であるホスホエノールピルビン酸(PEP)がぴったりと収まるポケットの一部を形成する高度に保存されたグリシン残基の破壊を伴う。

モンサント社の研究者によって 1997 年に発表された論文では、EPSPS [71]とグリホサートの相互作用のいくつかの顕著な側面が指摘されている。これらの著者は、グリホサートが PEP 結合のアロステリック阻害剤として作用することを提案した。しかし、彼らはグリホサートの行動を例外的なものにするいくつかの事実を観察した。グリホサートの独自性に注目して、彼らは次のように書いている:「これまでのところ、除草剤としても EPSPS 阻害剤としても、グリホサートよりも強力なグリホサートのアナログまたは誘導体は確認されていない」。この記述は、似たような形状と生物物理学的特性を持つグリホサートの1000以上の異なる類似体がテストされたが、それらのどれもがEPSPS活性を抑制する上でグリホサートほど効果的ではなかったと述べた別の発表された論文で裏付けられている[70、72]。

モンサントの研究者は、EPSPSの様々な変異は、PEPの結合に対する効果対グリホサートの阻害に対する効果の点でむしろ矛盾した動作を持っていることを観察した[71]。PEP結合部位の保存されたグリシン残基を失う変異は、グリホサートに対する壊滅的でカテゴリカルな効果を持つが、PEPに対する効果ははるかに弱い。彼らは書いた: “例えば、ペチュニアEPSPSにおける保存されたグリシン-101をアラニン(G101A)に置き換えることは、PEPのためのKm(app)を40倍に弱め、kcatを2倍に減少させるが、グリホサートの阻害をほぼ5000倍にperturbs。” これは、グリホサートが、アラニンが置換された状態ではもはや一致しないDNAコードを介してグリシンを置換することによって機能するならば、予想されるだろう。

一方、PEPの結合を破壊する他の変異は、グリホサートの阻害にほとんど影響を与えなかった。例えば、枯草菌変異体のR104Kという変異の場合、酵素はグリホサート阻害に対してさらに敏感になったが、PEPに対する触媒効率は劇的に低下した。リジン(K)はアルギニン(R)よりも小さいので、グリホサートに対するこの刺激効果は、グリホサートの窒素原子上のメチルホスホニル基のための追加の余地を可能にするという点で意味があるかもしれない。同様の効果は、グリシン残基の置換を伴わない限り、PEP結合部位の他の変異についても観察された[71]。

トウモロコシのEPSP合成酵素をコードする遺伝子をいじるためにCRISPR技術を関与させたDowDuPontの研究者によって2018年に発表された論文[73]。それは、PEPに対する高い活性とグリホサートに対する高い抵抗性という点で、最良の結果をもたらした改変版の構造についての重要な洞察を明らかにした。D2c-A5 と呼ばれる最適化された変異体は、上記のペチュニア植物と同様に G101A 置換を有しており、予想通り、グリホセートに対して完全に不感応であった。しかし、余分なメチル基は、PEPの結合のための立体障害を作成したが、これは今PEPに合うようにポケットを拡大するように小さいアミノ酸を置換し、近くのアミノ酸への追加の変異によって修正することができる。我々が予測するように、グリシンが置換されている限り、グリホサートに対する感受性は失われる。

グリシン残基に衝突する突然変異は、ペプチド鎖に適合するグリホサートの能力を妨害する可能性があることが予想されるべきである。予想通り、場所101でプロリンの代わりにロイシンを置換することで、黄色ブドウ球菌はグリホサートの効果からEPSPSを保護する別の巧妙な方法を発見した[74]。この場合、よりかさばるロイシン残基は近くのグリシン残基に群がっているが、PEPの結合部位を全く動揺させない。グリホサートは、ロイシンとの立体障害のために、グリシンの代わりになることができなくなった。PEPに対する酵素活性は高いレベルで維持されているが、グリホサートの阻害は破壊されている。

おそらく、グリホサートがその高度に保存されたグリシン残基のために置換することによってEPSPSを阻害するという考えを支持するための最も顕著な研究は、重要なグリシン残基が位置96に位置している酵素の大腸菌(大腸菌)バージョンで実施されたものである[75]。この研究では、G96がセリンに変異され、タンパク質の機能に劇的な変化をもたらした。その正常な反応は完全に無効化されたが、その代わりに逆反応が可能になり、正常な生成物である EPSP が式酸-3-リン酸に変換され、ピルビン酸を放出するようになった。EPSPSのこのG96Sバージョンは、高度に生成物の阻害を介して式酸-3-リン酸によって阻害されたが、グリホサートの阻害に全く敏感ではなく、グリホサートを置換するためにグリホサートのための酵素内の重要なサイトでグリシン残基がないため、予想通り、阻害した。

一つは、今、大腸菌でG96の代わりにグリホサートの結果を想像することができる。このような破損した酵素は、G96S 突然変異と同様の挙動を示し、反応を逆に駆動する可能性が高い。EPSPS分子のわずか数%が影響を受けるだろうが、彼らは酵素の無傷のバージョンの反応生成物を元に戻すことによって、EPSPの生産に対して働くだろう。正味の結果は、その後、G96-グリホサート置換酵素によってピルビン酸と式酸-3-リン酸に戻されるEPSPを生産するために使用されるPEPのリン酸結合におけるエネルギーの無駄である。

コーディングアミノ酸を置換するグリホサートの能力は、ユニークなものではない。他の毒性物質の研究文献にはいくつかの例があり、その多くは天然に産生されたものであり、アミノ酸置換によってその毒性作用を生じる。その一つがグルホシネートであり、天然に産生されるグルタミン酸のアミノ酸類似体であり、グリホサート耐性雑草を処理するための代替除草剤として現在人気を集めている[76]。ファインフェスクのいくつかの種は、フェニルアラニン(一般にメタチロシンとして知られている)の非コード化アミノ酸アナログである3-ヒドロキシフェニルアラニンを大量に根圏に放出し、これが細胞毒素(除草剤)として作用して他の種の植物の根の成長を阻害する。研究者らは、m-チロシンが作物管理における天然除草剤として有用である可能性を示唆している[77]。他の例としては、プロリンのアナログであるアゼチジン-2-カルボン酸(Aze)[78]、セリンのアナログであるβ-メチルアミノ-L-アラニン(BMAA)[79、80]、およびアルギニンのアミノ酸アナログであるL-カナバニン[81]が挙げられる。これらのアミノ酸類似体はすべて、多様な数のタンパク質の機能を破壊することにより、多くの場合、長い潜伏期間を伴う重篤な疾患を引き起こす。

5. グリホサートとリン酸塩結合

私たちは、EPSP シンターゼ以外の多くのタンパク質のリン酸結合部位も、その部位の保存性の高いグリシン残基がグリホサートに置換された場合に特に影響を受けやすいのではないかという仮説を立てました。アデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)、ピリドキサール-5′-リン酸(PLP)、グルコース-6-リン酸(G6P)、フラビンモノヌクレオチド(FMN)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)など、非常に重要な小リン酸含有分子を結合するタンパク質は膨大な数にのぼる。EPSP合成酵素のリン酸塩結合部位の特徴を研究することは洞察に富み、より一般的には、リン酸塩を結合するあらゆるタンパク質のリン酸塩結合部位の特徴を研究することは洞察に富む。

ほとんどのリン酸塩結合部位は特定のモチーフによって特徴付けることはできないが、タンパク質のリン酸塩結合部位の特徴を捕捉するために統計的アプローチを使用することが可能である。このようなアプローチは、ATP結合部位に特に興味を持っていた研究者のチームによって成功裏に使用された[82]。彼らは168の非冗長なATPタンパク質結合鎖を分析し、機械学習アプローチを使用して、どのアミノ酸が優先的にリン酸結合部位に関連付けられていることを特徴づける組成データを作成した。彼らは、グリシンは、3つの正に帯電したアミノ酸アルギニン、リジンとヒスチジンと一緒に、ATPと相互作用する残基である可能性が統計的に有意に高いことを発見した。彼らは要約した。”それは、Glyと正に帯電したアミノ酸がATPとの相互作用のために重要であることを推論することができる。” 正に帯電したアミノ酸は、場所でそれを固定するために負に帯電したリン酸部位に水素結合することができ、グリシンは、最小のアミノ酸であることから、これは合理的であるが、柔軟性だけでなく、リン酸アニオンのための部屋を提供する。このモデルは、EPSP シンターゼのためによく適合する。大腸菌のEPSP合成酵素は、PEP結合部位に存在するヒスチジンとアルギニン残基と同様に、2つのリジン残基を持っている[83]。グリホサートのメチルホスホニル基は、隣接する正に荷電したアミノ酸への静電結合によって助けられて、タンパク質合成中にリン酸を意図したポケットに十分に固定されている可能性が高い。

この原理は、おそらくピリドキサール5′-リン酸(PLP、ビタミンB6)のような他のリン酸化リガンドに関連したリン酸塩結合に引き継がれる。例えば、2つのグリシン残基(Gly219とGly257)だけでなく、アルギニン(Arg258)とヒスチジン(His179) (両方とも正に帯電している)は、酵素リジンデカルボキシラーゼ[84]におけるPLPのリン酸部位への結合の安定化にすべて関与している。ミトコンドリアのδ-アミノレブリン酸合成酵素(ピロール合成の速度制限酵素)は、ピリドキサールリン酸塩を補酵素として必要とし[85]、残基274から始まるGxGxxGモチーフ(GAGAGG)と残基417から始まるグリシンに富んだ配列(GLYGARGGG)を有する。グリホサートによるこの酵素の阻害機構[58]は、リン酸結合部位でのグリシン置換が関与している可能性がある。

キナーゼは、ATPから基質にリン酸塩を移動させる酵素の重要なクラスである。彼らのATP結合部位は、特に中間のグリシンがほぼ普遍的に存在し、ATP分子のγリン酸塩を調整し、リン酸基転移を促進するため、触媒にとって重要である、特徴的なグリシンに富んだモチーフ、GxGxxGを持っている。オリゴヌクレオチド指示突然変異誘発を使用した重要な研究では、セリンまたはアラニンで最初の2つのグリシンのいずれかを置換すると、ATP加水分解の速度を増加させるが、急激に基質へのリン酸基転移を減少させ、キナーゼに重大な影響を持っていたことを示した。言い換えれば、ATPリン酸結合のエネルギーが無駄になったのである。これは、上で議論したEPSP合成酵素のG96S置換と類似している。

注目すべきは、タンパク質の発現を見た大腸菌の研究は、複数のATP結合部位タンパク質がグリホサートの存在下でアップレギュレートされたことを発見した[86]。本論文の付録のATP結合部位に関するデータを表1としてここに転載する。アップレギュレーションは、グリホサートがATP結合部位でタンパク質に挿入され、その触媒活性を混乱させているという事実の結果である可能性がある。これらのATP結合部位の多くは、トランスポーターが関与しており、細菌のトランスポーターのATP結合部位は、通常、グリホサートの破壊に非常に影響を受けやすいであろうウォーカーA GxxGxGKS/Tモチーフを持っている[87]。

表1 グリホサート曝露に応答して大腸菌によってアップレギュレートされたATP結合タンパク質。Lu et al 2013年[86]より転載。
  • タンパク質のフォールドの増加
  • D、D-ジペプチドペルメラーゼ系、ATP結合成分2.83
  • ニッケル輸送系のATP結合タンパク質 2.24
  • グリシン、ベタイン、プロリンの輸送系のATP結合成分 12.96
  • ABCスーパーファミリーの融合D-アロートランスポーターサブユニット ATP結合成分 2.03
  • マルトースの輸送系のATP結合コンポーネント 2.38
  • ATP結合型糖質トランスポーター 2.10
  • 鞭毛特異的ATP合成酵素 2.07
  • 鞭毛特異的ATP合成酵素 2.07
  • 輸送系のATP結合コンポーネントの仮説部分 2.31
  • 輸送系のATP結合コンポーネントの仮説的部分 2.31

FADは、その中心にピロリン酸(PPi)部位を持っており、FADを結合する複数の酵素の研究では、PPi結合部位に特徴的なグリシンに富んだモチーフ、GxGxxG、を明らかにしている。特に2番目のグリシンは、その側鎖が欠落しているため、FADのPPiの酸素原子との密接な接触を可能にしている[88]。ここでのグリホサートの置換は、配列GAGGAGAGでFADを結合するミトコンドリア複合体IIにおけるコハク酸脱水素酵素の酵素活性の観察された抑制の原因となるかもしれない[89]。

リビュロース-1、5-ビスフォスフェートカルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RuBisCO)は、間違いなく地球上で最も一般的なタンパク質である。これは、植物における炭素固定の最初の主要なステップに関与している。特筆すべきは、22個の完全に保存されたグリシン残基を含み[90]、3つの異なる部位でリン酸塩を結合することである[91]。複数の研究により、グリホサートが植物のこの酵素を抑制することが明らかになっている。De Maria らは、10 mM のグリホサートを散布してから 1 週間後に Lupinus albus の葉で RuBisCO 活性が 26%減少することを発見した [92]。Picoli らは、グリホセート耐性ライグラスにおいて、グリホセートに曝露した後に CO2 の同化率が低下することを発見した [93]。Zobioleらは、グリホセート処理したグリホセート耐性ダイズの植物が、光合成の速度が低下するためにクロロチック(黄色)になることを観察した[94]。

6. グリホサートと他の有害元素との相乗効果

疾病動向の統計的分析によると、米国では過去 20 年間に主要作物へのグリホサート使用量の劇的な増加に伴い、複数の慢性疾患の発生率が増加していることが示されている。ここでは、グリホサート使用量の増加と末期腎疾患(図 2)、腎不全による死亡者数(図 3)、膀胱がん(図 4)との相関関係を示した Swanson ら(2014 )[61]の論文から、3 つの図を転載する。いずれの場合も、相関関係が偶然に発生した可能性を示すp値は非常に小さく、最初の有効数字の前には数個のゼロがある。

 

図2
年齢調整された末期腎疾患死亡者数とグリホサート散布と米国産トウモロコシおよび大豆作物のうちGEである割合との相関。Swanson et al 2014年より)[61]。

 

図3
年齢調整済み腎不全死亡者数とグリホサート散布と米国産トウモロコシ・大豆作物のうちGEである割合との相関。Swanson et al 2014年より)[61]。

 

図4
年齢調整した膀胱・尿路がんとグリホサート施用とGEである米国産トウモロコシ・大豆作物の割合との相関。Swanson et al 2014年より)[61]。


このセクションでは、グリホサートが他の毒性曝露と協働してCKDuへの感受性リスクを増加させることがどのように予想されるかを議論する。いくつかのケースでは、機能不全がCKDuと関連していることが知られているタンパク質の適切な機能における特定の重要なグリシン残基の具体的な役割についての研究文献を引用する。まず、グリホサートをベースとした製剤が、超低用量であっても腎臓に強力な悪影響を及ぼすことが、ラットの研究で示されていることに留意すべきである。2015年に発表された研究では、超低用量のラウンドアップに曝露した後の肝臓および腎臓の遺伝子発現に関するトランスクリプトーム解析が行われた[95]。彼らは、ラウンドアップは肝臓と腎臓の両方で、アップレギュレーションされたタンパク質とダウンレギュレーションされたタンパク質の数千の遺伝子発現に変化を誘導することを発見した。彼らは、「観察された遺伝子発現の変化は、線維化、壊死、リン脂質症、ミトコンドリア膜機能不全、虚血と一致しており、解剖学的、組織学的、生化学的レベルでの病理学的観察と相関しており、これを確認している」と指摘している。彼らは結論の中でこう書いている。”ここで発表された研究の結果は、許容されるグリホサートに相当する濃度で、はるかに低いレベルのGBH製剤の消費が、肝臓および腎臓のトランスクリプトームの広範囲にわたる変化と関連しており、これらの臓器における肝臓および腎臓の解剖学的および生化学的病理学的変化の観察された徴候と相関していることを示している”。[95]、 p. 13.

Laura Lopez-Marinらは、CKDu患者の46の生検を検討する中で、炎症性単球浸潤の有無にかかわらず、間質性線維化と尿細管萎縮を見いだした[8]。さらに、全身性硬化症、糸球体サイズの増大、一部糸球体房の崩壊、糸球体外血管の病変(中膜の内膜増殖や肥厚・空胞化など)が観察された。

6.1. グリホサートとチトクロームP450の障害

チトクロームP450(CYP)酵素は、肝臓における何千もの内因性および外因性化学物質の代謝を担っている。欠損したCYP酵素は、様々な薬剤やマイコトキシンの毒性に対する急性感受性につながる可能性がある。CYP酵素は、重要なマイコトキシンであるフザリウム産生T-2毒素の解毒において重要な役割を果たすことが示されている[96]。

さらに、P450分子は、ステロイドホルモンであるビタミンAおよびビタミンDの産生に重要である。炎症を含むCKDと密接に関連するいくつかの疾患過程において基本的な役割を果たしている[97]。ビタミンDはまた、透析患者にみられる死亡率の人種差にも役割を果たしている可能性がある [98]。いくつかの研究では、パリカルシトールなどのビタミンD類似体による治療により、腎不全患者の平均寿命が増加することが報告されている[99](およびその参考文献)。ビタミンD代謝における3つの最も重要なステップ、25-水酸化、1α-水酸化、および24-水酸化は、すべてCYP酵素によって行われる[100]。

CYP酵素のP450ファミリーは、2つ、しばしば3つの高度に保存されたグリシン残基を持つFGxGRHxCxG(CXGとしても知られている)として特徴づけられるシグネチャーモチーフを持っている[101]。このモチーフはヘム結合鉄中心に位置しており、ヘムの合成もまた、成分ピロール環の合成における律速段階であるδ-アミノレブリン酸合成酵素によって触媒される反応に対する基質としてのグリシンの競合的阻害を通じて、グリホサートによって阻害される[58]。グリホサートによる鉄のキレート化もまた、鉄のバイオアベイラビリティーを損なう可能性がある。CYP酵素はまた、補酵素であるNADPHにも依存しており、この補酵素は酸素二量体を分解して基質に1つの酸素原子を付加する際に不可欠な役割を果たしている。高度に保存されたグリシン残基は、すべてのCYP酵素の触媒活性に必要な付属タンパク質であるチトクロムP450還元酵素のFMN結合部位でリン酸塩との主鎖水素結合を形成している[102]。CYP酵素とCYP還元酵素の両方には、リン酸化分子であるNADP(H)の結合部位がある。NAD(P)Hはトリプトファンから肝臓で合成され、グリホサートが破壊するシキメート経路の直接産物である[103、104]。したがって、グリホサートがラット肝臓のCYP酵素活性を高度に抑制することが示されていることは驚くに値しない[105]。

6.2. グリホサートと有害金属

有害金属、特にヒ素がCKDuの役割を果たしている可能性が高いとして、すでに複数の論文で言及されている。リン酸塩肥料は有毒金属の既知の供給源であるが、グリホサート除草剤の製剤も同様である。Defargeら(2018)の最近の論文では、グリホサートの複数の配合剤について有毒金属のレベルを分析した[20]。実際、彼らは多くの製剤でヒ素(As)、クロム(Cr)、ニッケル(Ni)、鉛(Pb)が高レベルで汚染されていることを発見した。1つを除くすべての製剤には許容レベルを超える(最大40倍)クロムが含まれており、1つを除くすべての製剤にはニッケルが含まれており、19のサンプルが許容レベルを超えており(最大62倍)、6つの製剤には許容レベルの最大11倍の鉛が含まれていた。[20] (p. 160).

2015 年に発表された Jayasumana らの論文は、グリホサートが有毒金属と相乗的に作用してスリランカの農業労働者の腎臓に害を及ぼす可能性があるという証拠を提供した [39]。彼らの研究では、患者、同じ地域に住む対照者、別の場所に住む対照者から採取した尿サンプルを調べた。複数の有害金属の尿中濃度は、一般的に患者とコロケーションした対照群の両方で、パンデミック地域外の対照群と比較して高かったが、最も顕著な発見は、非パンデミック地域の対照群と比較して、パンデミック地域の対照群(39倍)と患者群(46倍)の両方でグリホサートの排泄量が非常に高かったことであった[39]。

グリホサートは強力なキレート剤として、ヒ素を腸管バリアを越えて腎臓に輸送する能力があるはずであり、そこでヒ素は尿の酸性環境に放出されて腎細管にストレスを与えている[11]。また、類推してみると、末端流域の酸性環境でアルミニウムが放出されると、グリホサートがアルミニウムを脳に輸送し、脳幹核に損傷を与える可能性があることも提案されている[106]。クエン酸塩が同様のキレート機構を介して腸管バリアを越えてアルミニウムを運ぶことが知られているという前例がある[107]。調理に使用される標準以下の調理器具からのアルミニウムは、特に酸性の調理条件およびフッ化物ストレスと組み合わせた場合、スリランカのCKDuに寄与している可能性がある [108]。

6.3. 高リン酸化と損傷後の尿細管線維化

尿細管間質性線維症はスリランカのCKDuの中核的特徴である。スリランカ北部中央部のCKDu患者64人を対象とした研究では、間質性線維症と尿細管萎縮が主な病理組織学的所見であった [109、110]。この状態は、傷害に対する反応として誘発された浸潤性線維芽細胞による細胞外マトリックスの過剰産生によって特徴づけられる。損傷や酸化ストレスによって損傷を受けた腎細胞は、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)、内皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)などのサイトカインや成長因子を放出する [111、112]。これらのシグナル伝達分子の受容体は、典型的にはプロテインキナーゼであり、セリン/スレオニンキナーゼおよびチロシンキナーゼの2つの幅広いクラスのいずれかに属する。これらの受容体は、複数のセリン残基、スレオニン残基またはチロシン残基のリン酸化によって活性化され、起動されるカスケードは、正のフィードバックループにおける自己リン酸化を含むことができる。結果として生じるシグナル伝達経路は、最終的にはマトリックス産生に関与するタンパク質の発現の核内活性化につながり、線維化を誘導する[113]。

TGF-βは腎尿細管線維化に関連するサイトカインとしてよく知られている[113、114]。TGF-β受容体は、自身のセリン/スレオニン残基のリン酸化により活性化されるセリン/スレオニンキナーゼである。特に、配列185Thr-Thr-Ser-Gly-Ser-Gly192を含む「GSドメイン」と呼ばれるモチーフがあり、ここでは、セリンおよびスレオニン残基のすべてが潜在的なリン酸化部位である[115]。この配列内の4つのグリシン残基は、明らかにグリホサート置換の潜在的な部位である。生物物理学的な議論は、グリホサートのメチル-ホスホニル基がセリンのリン酸化の非常に強力な擬態になるという考えを支持している。アスパラギン酸とグルタミン酸の両方がホスホセリンミメッ トとして作用することが実験的に実証されており、この性質は、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換することでセリンの構成的なプセドリン酸化を誘導する実験で利用されている[116]。同様に負に帯電し、さらに密接に一致するグリホサート(メチルホスホネート対リン酸塩)は、同様の方法で作用するはずである。

実験では、セリン残基の代わりにアスパラギン酸やグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸を置換すると、リン酸化されたセリン残基と非常によく似た挙動が得られ、タンパク質が体質的に活性化されることが示されている。通常、セリンリン酸化によって活性化される酵素のゼブラフィッシュ版は、セリン残基を欠いているにもかかわらず、あたかも永久にセリンリン酸化されているかのように振る舞っている。酵素の解析により、欠損したセリンから2コドン離れた新規のアスパラギン酸残基が、活性化された状態に維持する負電荷を提供しているという結論に至った [117]。

セリン/スレオニンホスファターゼはTGF-βシグナル伝達を終了させる [118]。リン酸化されたセリンおよびスレオニンの脱リン酸化は、グリホサートがグリシンの代わりになることで問題になる可能性が高い。セリン/スレオニンホスファターゼは、GDxHG、GDxVDRG、GNHE、HGG、およびRGを含む、金属配位およびリン酸塩結合に関与する複数のグリシン含有シグネチャーモチーフを有する[119]。したがって、セリンに隣接するグリシンに対するグリホサート置換による偽リン酸化、およびホスファターゼにおける重要なグリシンに対するグリホサート置換によるホスファターゼ活性の障害の両方が、全身的に過剰なリン酸化に向けた細胞シグナル伝達を駆動し、線維化に関与するタンパク質の合成の核活性化につながると予想される。

複数の受容体チロシンキナーゼ(RTK)もまた、腎線維化の発生において重要な役割を果たしている[120]。表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、および血管内皮成長因子の受容体は、疾患プロセスに関与する受容体チロシンキナーゼのすべての例である[120]。癌、変性疾患、および心血管疾患の治療に使用される多くの薬剤は、チロシンキナーゼの阻害剤として作用する。これらの阻害剤のうち少なくとも2つ、Nintedanib [121] およびSuramin [122] は、CKDにおける腎線維化を減衰させることが示されている。

ホスホチロシンは通常、ホスファターゼ酵素によって積極的に脱リン酸化されるが、グリホサートの置換によってこれらが著しく阻害される可能性が高い。チロシンホスファターゼのシグネチャーモチーフである(H/V)CxxGxxR(S/T)の中心グリシン残基は高度に保存されている。T細胞タンパク質チロシンホスファターゼのこのモチーフ内の保存されたGly-127残基に対してプロリンまたはアラニンを置換すると、触媒活性が400倍に低下する結果となった[123]。このように、チロシン残基からリン酸塩を除去するプロセスは、グリホサートによっても阻害され、チロシンの全身的な過リン酸化をもたらす可能性が高い。

6.4. パラコートとMATE1

米国疾病予防管理センター(CDC)によると、パラコートは世界で最も一般的に使用されている除草剤の一つである。スリランカでは、1980年代には雑草の防除のために水田でパラコートが広く使われていた。1990年代半ばまでにはグリホサートが人気のある代替品となったが、これはパラコートの急性毒性がより評価されるようになったことと、グリホサートがより安全な代替品であると考えられたからである。CKDuがスリランカで初めて認識されたのは1990年代半ばで、パラコートとグリホサートの両方が積極的に使用されていた頃である。

パラコートは2007年以降、欧州連合(EU)によって禁止されているが、農薬の中で最も販売量が多いエルサルバドルを含む数百の国がパラコートを使用し続けている[124]。パラコートとグリホサートはともにサトウキビの出穂後除草剤として人気があり[125]、グリホサートは収穫直前にサトウキビを熟すために選択される除草剤である[126]。エルサルバドルでは、サトウキビ労働者の間で驚くべき割合で腎不全が発生している [53]。スリランカでは、自傷行為への使用に対する懸念から 2008年からパラコートが段階的に廃止され、グリホサートは2016年から禁止されたが、2018年には解禁された。しかし、どちらの製剤も闇市場で入手可能な状態が続いている。

パラコート(1、1′-ジメチル-4、4′-ビピリジニウムジクロリド)は、CKDuの標的部位である近位尿細管を介して腎臓で活発に分泌される。パラコートは、スーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種(ROS)を誘導し、最終的に近位尿細管を損傷させる[127]。これらの活性酸素は、DNA損傷や遺伝毒性を引き起こすだけでなく、膜脂質の破壊や細胞死を誘発する[128]。ウサギの腎尿細管を対象とした試験管内試験(in vitro)研究では、パラコートがミトコンドリアの電子輸送チェーンを混乱させ、酸化ストレスを誘発し、グルタチオンとエネルギー供給を枯渇させることが実証されている[127]。パラコートは、キノコ由来のネフロトキシンであるオレラニン(ビピリジニウム)と同様に、腎尿細管上皮細胞を選択的に標的とする [129、130、131、132]。近位尿細管への損傷は、排泄の低下を意味し、他の臓器への毒性を高める可能性がある [133]。

腎近位尿細管を特異的に標的とすることに加えて、タンパク質合成中にグリホサートがグリシンの代わりになるという議論に基づいて、パラコートがグリホサートと相乗的に毒性を持つという考えを支持する良い証拠がある。尿細管細胞の先端膜から尿細管腔へのパラコートの輸出を担当する主なタンパク質は、Multidrug and Toxin Extrusion 1 (MATE1)と呼ばれている。MATE1の欠損を持つデザイナーマウスは、尿細管細胞内への蓄積が非常に高いため、腎パラコート毒性に特に影響を受けやすい[128]。これらの著者は次のように書いている:”我々のデータは、MATE1がPQ [パラカン]の腎排泄において重要な役割を果たし、MATE1機能の破壊は、マウスにおけるPQ腎毒性を著しく増強したことを示した”。[128] (p. 2477).

4種からのMATE1の遺伝子配列のアラインメントは、4種すべての間で保存されている32個のグリシン残基、および4種のうち3種の間で保存されている別の6個のグリシン残基を明らかにしている[134]。観察されたヒトの一塩基多型(SNP)に関する研究では、MATE1のグリシン変異(G64D)と、関連タンパク質であるMATE2-Kの別のグリシン変異(G211V)の両方が、輸送活性を完全に廃止する原因となった[135]。この結果、尿細管内にパラコートなどの毒素が蓄積されることになる。これらの重要なグリシン、および他の高度に保存されたグリシンのいずれかに対するグリホサート置換もまた、おそらくタンパク質の機能を著しく破壊するであろう。

多剤耐性タンパク質1(MDR1)(p-糖タンパク質としても知られている)は、腎臓で発現する別の排出タンパク質であり、パラコートの毒性に対して保護することも示されている[136、137]。このタンパク質はATPに結合し、GxxGxGモチーフ(残基427で始まるGNSGCGと残基1070で始まるGSSGCG)に一致する2つのヌクレオチド結合配列を持っている。ATP加水分解は、膜を横切る基質の結合および移動に結合している[138]。したがって、リン酸塩結合部位でのグリホサートによる破壊の影響を受けやすいと考えられる。

6.5. 障害された抗酸化防御

CKDuと関連した遺伝子発現に関する研究では、抗酸化物質NADPHを再生する経路の律速酵素であるグルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PD)、グルタチオンの合成および還元型グルタチオンの回復に関与する酵素など、酸化損傷からの保護に関連したタンパク質がCKDuと関連してアップレギュレーションされることが決定された[139]。NADPHは、グルタチオンを還元状態(保護状態)に回復させるために必要である。これらの酵素の過剰発現は、CKDu患者が環境からの酸化剤に慢性的にさらされていることを示す指標である。

グルタチオン(GSH)は、二量体形態のGSSGへの可逆的な酸化によって酸化的損傷から保護することができるので、必須の抗酸化トリペプチドである。グルタチオンの欠乏はマイコトキシンに対する感受性を高める[140]。グルタチオンはグリシン、グルタミン酸、システインからなる。Seneffら(2017)[67]で提案されているように、グリホサートはそのグリシン残基を直接置換することでグルタチオンを破壊する可能性がある。ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)は、グルタチオンをその個々のアミノ酸に分解する酵素であり、成分が再取り込みのために血液中に分配され、別の細胞によって再びグルタチオンに再集合することができるようにと言われている。しかし、分解/再組み立てのための別の動機は、それが原因でグリシン残基のグリホサート置換に起因するトリペプチドの欠陥バージョンであることかもしれない。ラット精巣をラウンドアップに曝露した実験では、GGTを含むグルタチオン代謝に関与する複数の酵素のアップレギュレーション、および精巣内のグルタチオンレベルの枯渇が実証された[141]。特筆すべきことに、GGTは末期慢性腎不全に関連して高発現しており[142]、GGTの上昇はステージ4-5の腎不全患者における死亡率の独立した予測因子である[143]。

グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)は、グルタチオンとの共役を触媒して水溶性を高めることにより、多数の疎水性化合物の肝臓解毒に重要な役割を果たしている。アフラトキシンのグルタチオン結合体の胆道排泄は、このマイコトキシンの肝臓クリアランスのための重要なメカニズムである[144]。Gly-146は、GSTスーパーファミリーにおいて厳密に保存されている数少ない残基の一つである。この残基は、熱ストレスに直面しても内部水素結合ネットワークを維持し、高温条件下でのタンパク質の安定性をサポートするMotif IIと呼ばれる保存されたフォールディングモジュール内に位置している。このグリシンのためのアラニンまたはバリンのいずれかの置換は、適切な折り畳みに不可欠な保存されたループ螺旋部分構造を不安定にする[145]。

グルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PD)は、特に赤血球において重要な抗酸化酵素であり、グルタチオンの還元に必要なNADPHを再生する。したがって、抗酸化防御を維持する上で重要な役割を果たしている。G6PDの欠乏とCKDuとの関連性を検討した研究では、スリランカのCKDu患者の20%がG6PDを欠乏していたのに対し、対照群の2%しか欠乏していなかったことが明らかになった[1]。

G6PDにはリン酸塩を含む分子と結合する3つの領域がある。一つはその基質であるグルコース-6-リン酸に結合する領域である。もう一つは、最終的にNADPHに還元されるNADP+分子に結合する。第三の部位は、別のNADP+分子に強固に結合する領域であり、この部位は「触媒的NADP+結合部位」とは対照的に「構造的NADP+結合部位」と呼ばれている[146]。G6PDは、主にこれらのリン酸結合部位にリンクしているグリシンに複数の重要な依存性を持っている。G6PD内の高度に保存された配列は、グルコース-6-リン酸結合部位のグリシン残基、触媒的NADPH結合部位のGxxGDLA「ヌクレオチド結合」フィンガープリント、および基質結合部位の近くの別のEPPxGモチーフを含む9残基配列を含む[147]。488の位置にあるグリシン残基は、構造的なNADP+結合部位内にある。

血清中に存在するグリホサートは、赤血球によって容易に取り込まれ、これらの重要なグリシン残基の代わりにG6PDに取り込まれ、酵素活性を阻害する可能性がある。G6PDはヒトで最も変異の多い酵素の一つである。よりかさばるアミノ酸への変異は、NADP+への結合親和性を低下させることが示されている[146]。G6PDのグリシン-アルギニン変異(G447R)は、非常に低い残存活性をもたらし、結果として重度の慢性溶血性貧血を引き起こす[148]。G274K変異はまた、酵素の欠陥バージョンをもたらす[149]。

Gaoら(2019)[150]は、細胞培養モデルを用いて、グリホセートベースの除草剤によって腎臓が損傷を受け、腎近位尿細管が主な標的となる可能性があることを示している。市販の製剤の毒性は十分に確立されているが、著者らは、グリホサート系除草剤の有効成分であるグリホサートが、NMDAR1/カルシウム流入/酸化ストレス経路を介して、試験管内試験(in vitro)および生体内試験(in vivo)の両方で腎尿細管上皮細胞を傷害することを実証している。彼らの知見は、”グリホサートのリスクを評価し、CKDuの病因を探るための理論的基礎と参考データを提供する “と述べている。

6.6. アクアポリンと脱水

アクアポリンは、膜中に孔を形成して膜を介した水の輸送を促進する一連の一体型膜タンパク質である[151]。アクアポリンは腎尿細管において特に重要であり、尿を濃縮し、水分損失から保護するために、腎髄質上皮を横切る浸透圧水輸送を仲介する。アクアポリンの発現は、バソプレシンによって媒介される脱水に反応してアップレギュレートされる[152]。イブプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬は、水分制限ラットにおいてアクアポリン2の発現を減少させることが示されている[153]。非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)の使用は、尿を介した水分の過剰な喪失に起因するCKDuの原因因子である可能性が示唆されている。夜尿症はCKDuの初期症状としてよく見られるものである。エルサルバドルの農業共同体のCKDu患者の女性を対象とした研究では、40%の女性がNSAIDSを服用しており、半数の女性が夜尿症に苦しんでいたことが示された[154]。

グリホサートはまた、Seneff and Orlando(2018)[66]で論じられているように、アクアポリン中の特定の重要なグリシン残基への置換を介して、尿を介して水の過剰な損失を引き起こす可能性がある。ほとんどのアクアポリンは、2つの高度に保存されたグリシン残基を含む。膜貫通らせん(TM)2のGly-57、およびヒトのアクアポリン1では2つのらせんが交差する接触点のTM5のGly-173である[155]。アクアポリン6は、通常のGly-57の代わりにアスパラギン残基を持ち、このアクアポリンは水チャネルとしてではなく、むしろイオンチャネルとして機能する。このことは、他のアクアポリンでグリホサートをGly-57に代用すると、保水機能が大きく損なわれることを示唆している。アクアポリン 6 のこのアスパラギン残基をグリシンで置換すると、この残基は再び水チャネルに変換され、アクアポリン 0、1、2 のこの部位のグリシンを置換すると、水トランスポーターとしての発現が完全にブロックされた [155]。

グリホセートで処理されたグリホセート耐性ダイズ植物は、グリホセートに曝露されていない植物と比較して、干ばつに敏感で、水をバイオマスに変換する効率が低い。Zobiole ら(2010)[94]は、1 回の処理で散布したグリホセートの量と、出芽後 58 日目までに吸収した水の量との間に、非常に有意でほぼ完全な線形関係があることを発見した。彼らは、正確なメカニズムは不明であることを認めながらも、アクアポリン機能の混乱が原因ではないかとの仮説を立てた。

6.7. シアノバクテリアとグリホサート

有毒性シアノバクテリアはスリランカの水路、特にCKDuがパンデミックしている北部中央州で問題が拡大している[156]。毒素性シアノバクテリアの過剰増殖が人間活動、特に農業地域での活動に関係していることは明らかであり、リン酸塩や硝酸塩肥料の農業流出がシアノバクテリアの増殖を支えている。グリホサートも主要な寄与因子である可能性が高い。グリホサートは、水路の有益な種を殺すことはできるが、シアノバクテリアを殺すことはできない。シアノバクテリアは実際には、グリホサート中の難解な C-P 結合を破り、グリホサートを完全に代謝し、グリホサート中のリン原子をリンの供給源として利用することができる [157]。DrzyzgaとLipok [158]は、グリホサートがシアノバクテリアのリン利用戦略にとって重要な要素であることを実証している。

シアノバクテリアは腎毒性であることが知られている複数の毒素を産生し、近位尿細管上皮細胞の壊死を引き起こし、遠位尿細管内の細胞破片の蓄積を引き起こす[159]。

6.8. マイコトキシンとスルホトランスフェラーゼ

CKDuの発症には、様々な真菌種が産生する有害代謝物が関与している可能性がある。フモニシンB1(FB1)、デオキシニバレノール(DON)、ゼアラレノン(ZEA)などのフザリウムマイコトキシンは、世界的に最も頻繁に発生しているマイコトキシンであり、小麦などの食品に含まれている一般的な汚染物質である。ラットを用いた研究では、これらの代謝物は主に膜脂質への酸化損傷の誘導を介して、肝臓と腎臓の両方に毒性があることが示されている[160]。スリランカ北部中央州のCKDu患者31人を対象とした研究では、アフラトキシン、オクラトキシン、フモニシンがそれぞれ61.29人、93.5人、19.4%の患者から検出された[161]。アフラトキシン(AF)、ゼアラレノン(ZEA)およびデオキシニバレノール(DON)は、真菌の最も一般的な毒性代謝物の3つである。

DONおよびZEAはいずれも、スルホトランスフェラーゼ酵素によってスルホン化されることが可能であり、これによって、元の毒素よりも可溶性が高く、毒性が著しく低い代謝物が生成される。例えば、アスペルギルス種が硫酸塩との共役を介してZEAを無害化することができることが実証されており[162]、フザリウムに感染したコムギ植物が複数の硫酸化共役体のDONを生成することができる。DON-15-硫酸塩は在来毒素に比べて約44倍の阻害性を示し、DON-3-硫酸塩には毒性は認められなかった[163]。グリホサートがアスペルギルス種を殺すか、硫酸化代謝物の合成を阻害している可能性があり、そのどちらもが土壌中でのマイコトキシンの産生を加速させることになる。例えば、グリホサートをベースとした除草剤を農業で使用されている量の100倍も低い用量で適用すると、真菌アスペルギルス・ニデュランズ(Aspergillus nidulans)に致死的な影響を与える[164]。スルホトランスフェラーゼは、活性化スルホネート供与体であるPAPSが酵素に結合する活性部位のGXXGXXKモチーフの高度に保存された2つのグリシン残基に依存しているため、グリホサートは硫酸化代謝物の合成を阻害する可能性がある[165]。ヒトの肝臓はまた、スルホン化を介して複数の外来物質を無害化し、より可溶性で毒性の低い生成物を生成し、その後、より容易にクリアすることができる。肝臓はグリホサートの毒性に対して非常に脆弱である[95]。その理由の一つは、スルホン化経路の混乱であると考えられる。

7. 結論

CKDuは多因子性疾患であることがますます明らかになってきているので、その地域の環境の健康状態や、そこに住んでいる人や働いている人の病気のプロセスを理解することで、複雑な可能性を狭めることができるようになる。因果関係の網は、関連する要因と研究の道筋を示し始めることができる。私たちはグリホサートの毒性のもっともらしいメカニズムを提案したが、これはタンパク質合成時のコーディングアミノ酸グリシンの置換に関係しており、これがCKDuに関連する他の複数の因子の毒性の増加につながることを理論的に示した。図5は、特にグリホサートが実際にグリシンに置換されている場合の、他の化学物質曝露とのグリホサートの様々な相乗効果をまとめた概略図である。

 

図5

グリホサートが腎臓病を引き起こす可能性のある複数の方法を模式的に示したもので、他の複数の毒性曝露と連動している。詳細は本文を参照のこと。


この論文で概説されている因果関係から、CKDuの負担を軽減するために取るべき最も重要な手段の一つは、スリランカでのパラコートとグリホサートの商業販売を停止し、これらの農薬の闇市場での入手を止めることであることがわかる。これを実際に行うのは難しいかもしれないが、非標的毒性化学物質への曝露を最小限に抑えながら、効果的な低コストの雑草防除を提供する実行可能な代替案を見つけるための研究が切実に必要とされている。

農作物の生産性を向上させ、その後の農業生態系や人間の健康へのダメージを与えない農法や農法は十分に文書化されている。これらの方法や慣行は、作物、文化、気候、その他多くの要因によって異なるが、いくつかの核となる原則を共有している。すなわち、土壌の健全性の向上、バイオマスの再利用、カバークロップの利用、地上と地下の生物多様性、植物と人間の両方に利益をもたらす相互作用と相乗効果に焦点を当てた生態学的な考え方である。これらの原則の一部を利用している世界の農地の少なくとも3100万ヘクタール(7700万エーカー)は、農薬を使用せずに管理されている[166]。

生態系へのアプローチの1つは、土壌の健全性を向上させながら、作物生産において化学薬品を使用した窒素肥料とリン酸肥料を有機肥料に置き換えることである。これは、例えば、水質汚染を減らし、毒素を産生するシアノバクテリアの過剰増殖を防ぐのに役立つであろう [156]。化学ベースのリン酸塩肥料を有機肥料に切り替えることも、ヒ素への曝露を減らすのに役立つだろう [167]。

CKDuの可能性を減らすためには、他にも対策がある。暴露リスクを最小化するために、農薬を使用する際に保護具を着用するように、教育とアクセスの改善を通じて労働者を支援することができる。政府機関やその他の機関は、CKDuの影響を受けた地域で環境モニタリングやバイオモニタリングを実施し、原因となる局所的な要因をよりよく理解することができる。逆浸透フィルターで汚染水を処理する取り組みを拡大することができる[167]。CKDuの治療に関しては、特定の薬剤やプロトコルを議論することは本稿の範囲を超えている。しかし、透析や腎臓置換術などの高度な治療法は、アクセスの欠如や法外なコストのため、農業従事者にとって現実的な選択肢ではないことが多いため、予防対策に重点が置かれるべきであることは明らかである。

我々の研究では、パラコートのような他の農業毒物の存在下で、いくつかの代謝プロセスに対して、特にグリホサートが相乗効果を発揮する可能性があり、また、農業従事者の高温気候、気温の上昇、脱水などの不利な環境や職業的条件が、CKDuで説明される腎疾患を引き起こす可能性があることが示されている。これらの要因がCKDuの原因となっているかどうかについては、今後の研究が必要であると考えられる。

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