グリホサートは十分な芳香族アミノ酸レベルがあれば腸内環境の細菌群集組成に対する短期的な影響は限定的である。

強調オフ

GMO、農薬グリホサート

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Glyphosate has limited short-term effects on commensal bacterial community composition in the gut environment due to sufficient aromatic amino acid levels

www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0269749117328099

ハイライト
  • グリホサートの腸内細菌への影響に焦点を当てた初の動物暴露試験。
  • グリホサートは、生体内の腸内細菌叢組成に及ぼす影響は非常に限られている。
  • 腸内芳香族アミノ酸がグリホサートの抗菌効果を緩和する。
  • グリホサートの経口曝露は、腸内内容物のpHを上昇させる。

1. 序論

世界的には、グリホサート系除草剤は、雑草の防除とグリーンバーンダウンのために農業に広く適用されている(Bøhn er al)。、 2014)。1970年代後半以降、世界的に適用されているグリホサート系除草剤の量は、特にこれらの除草剤に耐性を有する遺伝子組み換え植物の導入後、約100倍に増加している(Myers er al)。、 2016)。

農作物へのグリホサートベースの除草剤の適用は、必然的にグリホサート残留物およびその主要代謝物であるアミノメチルホスホン酸(AMPA)が収穫時に作物に残留し、消費者に到達する可能性がある(Myers et al 2016)。

近年、食品中のグリホサートの生物学的に有意な残留レベルについては、多くの議論がなされてきた。いくつかの研究では、規制上の最大残留量(MRL)および許容一日摂取量(ADI)レベル以下での曝露に よる悪影響の可能性を主張している(Benedetti et al 2004 年、Larsen et al 2014 )。

ヨーロッパでは、MRL は作物によって異なり、製品の種類ごとに個別に定義されている。大麦とオーツ麦(穀物)の場合、MRLは30mg/kgであり、ADIは1日あたり0.5mg/kg体重に設定されている(EFSA、 2015)。

人間は、果物、野菜、その他の農産物の消費や飲料水からもグリホサートの残留物にさらされる可能性がある。これは公衆衛生上の重大な懸念であり、いくつかの研究で一般人の尿中にグリホサートが存在することが示されている(Conrad er al)。、 2016、 Krüger er al)。

 

グリホサートを含む農薬の経口毒性を評価する場合、腸内環境内の細菌群集への潜在的な影響は、最近までほとんど注目されていなかった(Jin et al 2017年、Liu et al 2017年、Shehata et al 2013)。しかし、腸内細菌叢と総称されるこの非常に複雑な生態系の重要性は、人間の健康における重要性の認識が高まっていることから、近年、計り知れないほどの科学的注目を集めている(Arrieta and Finlay、 2012、 Butel、 2014、 Jandhyalaら、 2015)。

また、腸内微生物叢の自然な恒常性が、抗生物質治療(Dethlefsen et al 2008)、食習慣(David et al 2013)、および異生物性化合物への暴露(Lai et al 2016、Nasuti et al 2016)などの外部影響に対して敏感であることも十分に確立されている。

この複雑なバランスの調節は、代謝性疾患、肝疾患、冠動脈疾患および消化器疾患(例えば、炎症性腸疾患)などのいくつかの疾患と関連している(Sheehan er al)。 腸内微生物叢と宿主の健康との間のリンクは、難消化性食物繊維の細菌による分解によって部分的に駆動され、その結果、短鎖脂肪酸(SCFA)が生成される(Russell et al 2013)。

酢酸、プロピオン酸および酪酸を含むSCFAは、腸球の栄養として機能し(BrüssowおよびParkinson、2014)、食欲調節(Byrne et al 2015)および免疫恒常性(WuおよびWu、2012)の両方に関与しているので、人間の健康にとって重要な役割を果たしている。腸内のSCFAの中で最も優勢であり、多くの異なる細菌種によって産生される酢酸は、大腸上皮において抗炎症作用を誘導し、大腸菌感染を予防することが示されている(Fukuda er al)。、 2011)。

 

グリホサートが除草剤として特許を取得した頃(Franz、 1974)にはすでに、活性化合物に抗菌作用があることがわかっていた。グリホサートは、植物だけでなく、一部の細菌、藻類、真菌および寄生虫において、芳香族アミノ酸生合成のシキメート経路の中心的な酵素ステップである5-エノールピルビルシキメート-3-リン酸合成酵素(EPSPS)を特異的に阻害する(Clair et al 2012年、McLeod et al 1998年、Priestman et al 2005)。

水生および土壌生活微生物に対するグリホサートの非標的効果の報告は数多くあり、グリホサートが実際に環境微生物群集に影響を与えることを示しており、例えば、ガンマプロテオバクテリア(Gammaproteobacteria)に属する細菌を選択的に増強し、シュードモナス菌(Pseudomonas spp.)およびアシドバクテリア(Acidobacteria)を阻害することによって(Newman er al)。 したがって、グリホサートはまた、腸内微生物群集の組成を潜在的に改変し、それによって宿主生物に負の影響を及ぼす可能性がある。

最近の試験管内試験(in vitro)研究によると、腸内環境に関連する細菌群集は実際にグリホサートによる干渉を受けやすい。ある研究では、腸内環境に関連する 23 種類の細菌種の最小阻害濃度(MIC)がグリホセート含有除草剤 Roundup UltraMax® に対して決定された。この研究では、ビフィズス菌、腸球菌、乳酸菌など、一般的に有益と認識されている細菌は、Clostridium perfringensやSalmonella spp.などの病原性細菌よりもグリホサート製剤に感受性が高いことが示された(Shehata et al 2013)。

しかし、トウモロコシサイレージ単独または高濃度(0.2% wt/wt)の Roundup Ultra®を混合した飼料を与えた羊のルーメン発酵の 生体内試験(in vivo) 試験では、15 日間の処理後、ルーメン発酵パラメータ(pH、アンモニア、揮発性脂肪酸)に変化は見られなかった(Hüther et al 2005 )。後者の研究と一致して、試験管内試験(in vitro)のウシ発酵モデルでは、口内代謝または細菌群集の組成に有意な影響を示さなかった(Riede et al 2016)。

グリホサートの効果が製剤化の方法に依存することがいくつかの研究で示されていることに注意することが重要である。ある 試験管内試験(in vitro) 研究では、3 種類の食品微生物 Geotrichum candidum、Lactococcus lactis subsp. cremoris、Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus に対する純粋なグリホサートと Roundup® (R400) の効果を比較した。

その結果、Roundup®は微生物の増殖を抑制する効果があるが、同濃度のグリホサートに曝露しても効果はないことがわかった(Clair er al)。 また、Braconi ら (2006) は、純粋なグリホセートは、酵母 Saccharomyces cerevisiae の細胞増殖と代謝への影響が市販の製剤よりも少ないことを報告している (Braconi ら、 2006)。

 

全体的に、文献から得られるデータは乏しく、グリホサートの腸内微生物群集への影響に関しては一部矛盾している。グリホサート残留物への経口曝露がヒトの健康に懸念されるレベルでヒトの腸内微生物叢を変調させる可能性があるかどうかは依然として不明である。

ここでは、純粋なグリホセートと市販のグリホセート製剤の腸内微生物組成、活性、宿主反応に対する影響を、スプラague Dawleyラットを用いた短期暴露試験で報告する。これまでの研究とは対照的に、我々は腸内環境における内因性芳香族アミノ酸の潜在的な緩和効果に取り組んでいる。

2. 材料と方法

2.1. 細菌株

本研究で使用した細菌株を表1に示す。すべての菌株は、脳心臓輸液用ブロス(BHI)(Oxoid)または強化クロストリジウム培地(RCM)で増殖させた。Escherichia coli ATCC 25922を2.5 mg チアミン/mL、0.5% グルコース(ABTG)を含むABミニマム培地(Clark and Maaløe、 1967)でさらに増殖させ、増殖培地中の芳香族アミノ酸の影響を検討した。

表1. 豊かな栄養分を含むブロスで生育した選択された細菌株のグリホサート(Glyfonova® 450 PLUS)に対する最小阻害濃度(MIC)。

種 類 細胞の種類 MIC (mg/mL) BHI MIC (mg/mL) RCM

  • ビフィドバクテリウム・アドレンシス DSM 20083 グラム+10 20
  • ビフィドバクテリウム・ビフィダム DSM 20456 グラム+10 20
  • ビフィドバクテリウム・ブレベ DSM 20091 グラム+10 20
  • ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスプ・インファンティス DSM 20088 グラム+10 20
  • ビフィドバクテリウム・アニマリス DSM 10140 グラム+10 20
  • ビフィドバクテリウム・アニマリス・ラクティス BL-04 グラム+10 20
  • Clostridium perfringens CCUG 1795 グラム + 10 20
  • クロストリジウム・レプタム DSM 753 グラム+10 20
  • Clostridium nexile DSM 1787 グラム+10 20
  • 腸球菌フェカリス ATCC 29212 グラム + 80 40
  • 腸球菌フェカリスDSM 2570 グラム+80 40
  • ラクトバチルス・ジョーンソニイ DSM 10533 グラム+20 20
  • 乳酸菌プラネタリウムDSM 20174 グラム+40 40
  • 乳酸菌ロイテリDSM 20016 グラム+40 40
  • ラクトバチルス・ラムノサス ATCC 53103 グラム+40 40
  • Bacteroides uniformis DSM 6597 グラム ・5 10
  • Bacteroides vulgatus DSM 1447 グラム ・5 20
  • Bacteroides ovatus DSM 1896 グラム ・10 20
  • Bacteroides fragiles DSM 2151 グラム ・5 40
  • 大腸菌 ATCC 25922 グラム ・80 20
  • 大腸菌 DSM 18039 グラム ・80 20
  • Akkermansia muciniphila DSM 22959 グラム ・20 20

BHI:Brain Heart Infusion broth、RCM:Reinforced clostridial medium。

2.2. 化学物質

製剤にはグリホサートを使用した。グリホサート(N-ホスホノメチル)グリシン(Sigma-Aldrich 1071-83-6)、モノイソプロピルアミンを対イオンとして有するグリホサート塩N-(ホスホノメチル)グリシン(Sigma-Aldrich 38641-94-0)、グリフォノバ®450プラス(450g/Lグリホサート酸換算) (FMC Corporationからの親切な贈り物、以前はCheminova A/S)およびラウンドアップ®ガーデン(120g/Lグリホサート換算) (Monsanto)を使用した。以下、下線部の名称を使用する。

芳香族アミノ酸分析のために、LC-MSグレードのアセトニトリル、メタノール、水酸化アンモニウムおよび蟻酸をメルク(ドイツ、ダルムシュタット)から入手した。LC-MS分析のためのすべての水溶液は、Milli-Q Gradient A10システム(Millipore、 Bedford、 MA)から入手した超純水を用いて調製した。l-チロシン、l-トリプトファンおよびl-フェニルアラニンを含む真正な芳香族アミノ酸化合物(表S1)は、Sigma-Aldrichから入手した。利用可能な最高純度グレードの芳香族アミノ酸内部標準(l-フェニルアラニン(環-d5、98%)、l-チロシン(環-d4、98%)、l-トリプトファン(インドール-d5、98%)およびインドール酢酸(2,2-d2、96%))は、ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ社(Cambridge Isotope Laboratories Inc. マサチューセッツ州アンドーバー)から購入した。

グリホサートおよびAMPA分析のために。酢酸アンモニウム、AMPA、アンモニア溶液25%、およびHPLC-MSグレードの水は、Sigma-Aldrich (St. Louis、 MO)から入手した。直接標識した内部標準物質、グリホサート-2-13Cおよびグリホサート(13C、 99%; 15N、 98%; メチレン-D2、 98%)は、それぞれSigma AldrichおよびCambridge Isotope Laboratories Inc. (Andover、 MA)からそれぞれ入手した。

2.3. 最小阻害濃度

ブロス希釈法を用いて、以前に記載されたように嫌気性条件下で増殖を阻害するグリホサートの最低濃度を決定した(Wiegand et al 2008)。一晩(ON)血液寒天プレートからの細菌(表1)をOD600 = 0.2に再懸濁し、さらにBHI、RCMまたはABTGブロスで1000倍に希釈し、37℃で嫌気的にONでインキュベートした寒天プレート上に細胞懸濁液をメッキすることにより、各実験で確認されたように、約105 CFU/mLを得た。

ブロスに農薬の作業溶液を調製し、2倍希釈系列の100μLを96ウェル平底マイクロタイタープレート(Nunc、ThermoFisher)に分散させた。その後、CFU調整した細菌懸濁液の100μLアリコートをウェルに移した。陽性および陰性対照を各実験に含めた。プレートは37℃で嫌気性条件下(80%N2、10%CO2および10%H2)で培養し、24、48および72時間後に検査した。各細菌株のMIC値は、目に見える成長を生じさせないチャレンジ農薬製剤の最低濃度として定義された。すべての実験は3回反復で実施し、2回繰り返した。

2.4. 細菌の増殖

生育実験は、最小培地(ABTG)中で大腸菌 ATCC 25922 を用いて行った。大腸菌は血液寒天プレート上で嫌気的に増殖させ、96 ウェルマイクロタイタープレート(Nunc、ThermoFisher)に ABTG ブロス中で OD600 = 0.05 の純培養物を接種した。グリホサート、グリホサート塩、Glyfonova®またはRoundup®を、活性化合物の最終濃度が0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、および0.16 mg/mLとなるようにウェルに添加した。3種の芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンの混合物をABTG最小増殖培地に添加し、最終濃度が0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mLとなるように3種のアミノ酸を添加した。生育実験は3倍体で行い、2回繰り返した。

2.5. 倫理的な声明

動物実験は、DTU国立食品研究所(デンマーク)の施設で行われた。倫理的な承認は、認可番号2012-15-0201-00553 C2でデンマーク動物実験検査院によって与えられた。実験は、動物のケアと使用のための国立食品研究所内の動物福祉委員会によって監督された。

2.6. 動物、ハウジングおよび実験デザイン

4週齢の雄のSprague Dawleyラット(n = 80)をTaconic Biosciences(Lille Skensved、デンマーク)から購入した。動物は実験期間中、水と飼料(Altromin 1324;Altromin Spezialfutter、Lage、ドイツ)を自由に摂取でき、制御された環境条件(12時間明暗サイクル、温度21.5±0.3℃、相対湿度51.3±3.1%、1時間あたり8-10回の空気交換)の下で飼育された。介入期間中、動物の体重を毎日記録した。

到着後、動物は無作為にペアでケージに入れられ、介入を開始する前に7日間順応させられた。2 週間の介入期間中、動物は水(CTR)、グリホサート 2.5 mg/kg/日(GLY5)、グリホサート 25 mg/kg/日(GLY50)、またはグリフォノバ® 25 mg/kg/日のグリホサート酸当量(NOVA)を経口投与された(図 2A)。グリホサート系製剤の毒性がpHに影響されることが判明しているため(Mann and Bidwell、 1999、 Tsui and Chu、 2003)、低pHによる直接的な影響を最小限に抑えるために、グリホサート溶液のpHをNaOHを用いてpH≒2からpH=5に調整した。糞便ペレットは、最初の処置の前に個々のラットから直接採取し、直ちに-80℃で凍結させた。2週間の介入期間の後、すべての動物をCO2/O2鎮静および断頭によって安楽死させ、血清調製のために血液を直接採取した。各ケージから1匹の動物(n=40)を解剖し、異常がないか検査した。盲腸全体を秤量し、回腸、盲腸および結腸からの腸内容物の複数のサンプルを採取し、液体N2中でスナップ冷凍するか、またはアミノ酸プロファイリングのために以下に記載するように処理した。

2.7. 細菌群集組成物

MoBio PowerLyzer™ PowerSoil® DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories、 Carlsbad、 CA)を用いて、ビーズを30サイクル/秒で10分間(Retsch MM 300 ミキサーミル)でビーズを叩くことを含む、製造者の推奨事項に従って、介入の初日に採取した250 mgの糞便サンプルおよび解離日の回腸、結腸および盲腸のルーメン含有量から細菌群集DNAを抽出した。総DNA濃度は、Qubit dsDNA HSキット(Life Technologes)を用いて測定した。細菌群集組成は、抽出した細菌DNA中の16S rRNA遺伝子の超可変V3領域の配列決定により決定した。V3領域の増幅およびIon Torrent PGMプラットフォーム(Life Technologies)を用いたシーケンシングは、以前に記載されているように行った(Laursen et al 2016、Tulstrup et al 2015)。簡潔には、各細菌群集に固有の10〜12bpのバーコードを有するユニバーサルフォワードプライマー(PBU 5′-Aアダプター-TCAG-バーコード-CCTACCGGGGCAGCAG-3′)およびユニバーサルリバースプライマー(PBR 5′-trP1-アダプター-ATTTCCCGCGCTGGCTGG-3′)を用いた単一の融合プライマーPCR戦略によりPCR産物を得た(供給者、Life Technecologes)。PCR反応は、鋳型として5 ngのコミュニティDNA、0.2 μL Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs Inc.)、4 μL HF-バッファー、0.4 μL dNTPs (各10 mM)、1 μMフォワードプライマーおよび1 μMリバースプライマーを20 μLの総量で含有した。PCR増幅プログラムは、98℃での30秒、98℃での15秒および72℃での30秒の24サイクル、72℃での5分間の最終伸長、および4℃への冷却を含んでいた。

続いて、PCR産物を、製造者の推奨事項に従って、96ウェルマグネットスタンド付きHighPrep PCR磁気ビーズ(Magbio)を用いて精製した。DNA濃度はQubit dsDNA HSアッセイ(Invitrogen社)を用いて測定し、サンプルを等モル濃度でプールして、回腸と盲腸、または結腸と糞便(介入前)のいずれかに由来するサンプルを含む2つの別々のライブラリを得た。DNA抽出およびライブラリの調製に先立ち、サンプルを治療群間で無作為化した。

シークエンシングは、DTU 社内施設(デンマーク工科大学 DTU Multi-Assay Core (DMAC)、DTU Multi-Assay Core (DMAC)、デンマーク工科大学)で、中央値 180 bp の長さを生成する Ion OneTouch™ 200 Template Kit v2 DL を使用した Ion Torrent シークエンシング用 318 チップを使用して実施した。シーケンシングデータを CLC Genomic Workbench(バージョン 8.5、Qiagen、Aarhus、デンマーク)にインポートし、さらに CLC Genomic Workbench で処理して、バーコードと PCR プライマーの多重化除去、トリミング、削除(フォワードプライマーとリバースプライマーの両方が 100% の相同性を持つ場合のみリードを保持)、さらに 110 bp 以下または 180 bp 以上のリードを破棄した。オペレーショナルタクソノミックユニット(OTU)は、最大期待誤差率(maxee)が1.5に設定されたUPARSE(Edgar、2013)を使用してdenovoピックアップし、OTUテーブルを生成した。分類は、Ribosomal Database Project multiclassifier version 2.10.1とRDPデータベース(Wang er al)。、 2007)を用いて、250bpより短い配列に対して推奨される信頼度のしきい値を0.5に設定して割り当てた(Claesson er al)。、 2009)。さらなる下流処理はQIIMEで行った (Caporaso er al)。、 2010)。系統樹を生成し(make_phylogeny.py)、すべてのOTUのアラインメントに続いてArcheaeの種にルートした。OTUテーブルは、細菌として割り当てられたOTUのみを含むようにフィルタリングされ、シアノバクテリア/クロロプラストグループと、全コミュニティの0.005%未満の平均相対的な存在量を持つOTUを除外した(Bokulich er al)。、 2013)結果として、合計547OTUとなった。QIIMEスクリプトcore_diversity_analysis.pyを用いて、13、000リードのレア度で、異なる分類学レベルでのα多様性指標と相対的な存在量を生成した。シーケンシングデータは、BioProject accession number PRJNA412959の下、NCBIに寄託されている。

2.8. 腸内サンプルの短鎖脂肪酸(SCFA)含有量とpH

各群の動物からの盲腸内容物を、GC-MS(MS-Omics、デンマーク)を用いて酢酸、プロピオン酸、酪酸およびバリン酸について分析した。簡潔に言えば、2μLのミリQ水/mgの糞を各チューブに添加し、超音波を用いてホモジナイズし、遠心分離の前にHClで酸性化した。上清をGC-バイアルに移し、内部標準を添加した。生のGC-MSデータをPARAFAC2モデルに基づくソフトウェアで処理し、1mgの糞便が1μLの体積に相当すると仮定して定量値を計算した(Zhao er al)。

介入期間の最終日に収集した糞便サンプルを滅菌水で1:1に希釈し、ボルテックスし、13、000 rpmで10分間遠心分離した。上清をクリーンチューブに移し、校正後、無作為に順不同にpHを測定した(Orion™ 3-star benchtop pH meter、 ThermoFisher Scientific)。

2.9. 腸内サンプル中のグリホサートとアミノメチルホスホン酸(AMPA)について

グリホサートおよび AMPA 校正標準物質を HPLC グレードの水で 1 mg/mL で希釈して調製した。約0.2 gの腸サンプルをプラスチックバイアルに移し、計量し、10 mLのHPLCグレードの水で希釈した。混合物は、ボルテックス、精力的に手で混合し、15分間超音波処理することにより均質化した。その後、バイアルを6000 rpmで20分間遠心分離し、上清の1 mLをHPLCバイアルに移した。安定同位体標識した内部標準溶液(各10μg/mL)を各サンプルとグリホサートとAMPAの校正標準溶液に合計50μL添加した。腸サンプルを、回腸、盲腸および結腸サンプルについて分離したバッチで分析した。各バッチでは、分析対象物のキャリーオーバーを避けるために、サンプルは濃度の高い順に分析した。

グリホサートとAMPAの分離のために、ルナNH2カラム(3μm、50×2mm)を使用してHILICクロマトグラフィーを実施した。水性移動相は、10mMの酢酸アンモニウムを含む水を25%アンモニア水溶液でpH10に調整したものを用いた。有機移動相はアセトニトリルであった。デュアル低圧混合三元勾配システムDionex UltiMate 3000(Thermo Scientific社)を装備したHPLC-MS/MSに10μLの体積のサンプルを注入した。質量分析計は、API 4000 (ABSciex、 Framingham、 MA、 USA)であり、キャピラリー電圧5500 Vで400℃に設定されたポジティブモードのESIソースで操作された。

グリホサートと AMPA は MRM モード(多反応モニタリング)で検出・定量した。定量化には、標識した内部標準物質を使用した。得られたデータは Analyst 1.6 ソフトウェアで処理した。検量線は、検量線の濃度に対して分析物と内部標準物質の間のピーク面積比をプロットすることで確立した。検量線は、重み付け係数1/xの線形回帰に適合させた。相関係数はすべての回帰で0.99以上であった。

2.10. 芳香族アミノ酸と代謝物のプロファイリング

23種の芳香族アミノ酸およびその誘導体、ならびに4種の内部標準物質(IS)のストック溶液(1 mg/mL)を、それらの真正化合物から、水、メタノール、または50%メタノール中で個別に調製した(表S1)。4つの安定同位体標準(各4μg/mL)をすべて含むIS溶液を調製した。23種類の芳香族アミノ酸および誘導体を混合(標準ミックス)し、最終濃度が0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mLおよび4μg/mLとなるようにさらに水で希釈した。検量線の調製のために、IS溶液100μLをエッペンドルフチューブに入れ、窒素で乾燥させた。その後、標準ミックス(各標準ミックス濃度について)の100μLを各チューブに添加した。

動物(n = 40)の解剖中に、回腸、盲腸および結腸(200〜500 mg)の腸内容物を直ちに滅菌milliQ水で1:2希釈し、10秒間ボルテックスし、ステップ間の上清の転送でそれぞれ5と10分間16、000 g、4℃で2回遠心分離した。最後に、300μLのアリコートを分析まで-20℃で保存した。分析のために、サンプルは4℃で解凍し、16、000 g、4℃で5分間遠心分離し、上清を回腸内容物の1:100希釈と盲腸または結腸内容物の1:5希釈に対応する80μLの水の総量で希釈した。回腸、盲腸および結腸の品質管理(QC)サンプルは、3つのそれぞれのコンパートメントから各サンプルの10μLをプールすることによって調製した。各サンプルに、20μLのIS(4μg/mL)と240μLのアセトニトリルを添加した。チューブを10秒間ボルテックスし、-20℃で10分間放置してタンパク質を沈殿させた後、チューブを16、000 g、4℃で10分間遠心分離し、各上清(320μL)を窒素ガスで乾燥させた新しいチューブに移した。その後、残渣を80μLの水で再構成し、10秒間ボルテックス、16、000 g、4℃で5分間遠心し、分析まで-20℃で保存されていたLCバイアルに移した。

各コンパートメントからの腸管サンプルは、分析中の10サンプルごとに前後に注入された所定のコンパートメントのQCサンプルでランダムな順序で別々に分析した。5つの標準ミックス溶液も10サンプルごとに1回分析した。各サンプルについて、2μLの容量をDionex Ultimate 3000 RS液体クロマトグラフ(サーモサイエンティフィック、カリフォルニア州、米国)からなる超高性能液体クロマトグラフ四重極飛行時間型質量分析装置(UPLC-QTOF-MS)システムに注入し、正モードで動作するエレクトロスプレー間相(Bruker Daltonics、ブレーメン、ドイツ)を装備したBruker maXis飛行時間型質量分析計に結合させた。分析対象物は、以前に提案された設定に基づいて、寸法2.1 × 100 mm、粒子径2.7 μmのPoroshell 120 SB-C18カラム(Agilent Technologies、 CA、 USA)で分離された(Want er al)。 簡単に言えば、カラムは40℃で、サンプラーは4℃で保持した。UPLC移動相は、0.1%ギ酸の水(溶液A)と0.1%ギ酸のアセトニトリル(溶液B)で構成されている。0.4 mL/minの一定の流速を維持しながら、1%溶液Bを用いて1分間溶出し、3分間で15%までの直線的グラジエント、6分間で50%溶液Bまでの直線的グラジエント、9分間で95%溶液Bまでの直線的グラジエントを行い、10分間一定に保ちました。質量分析データは、50-1000質量/電荷(m/z)のスキャンレンジで2 Hzのフルスキャンモードで収集した。

次のエレクトロスプレー間相設定を使用した。ネブライザ圧力2 bar、乾燥ガス10 L/min、200 °C、キャピラリー電圧4500 V。MS/MS分析のために、10から30eVの範囲のランプ衝突エネルギーをスケジュールされたプリカーサーリストに適用した。測定精度を向上させるために、ギ酸ナトリウムクラスター(Sigma-Aldrich、Schnelldorf、ドイツ)を用いて外部および内部校正を行い、さらにロックマス校正(ヘキサキス(1H、1H、2H-パーフルオロエトキシ)ホスファゼン、Apollo Scientific、Manchester、イギリス)を適用した。

芳香族アミノ酸および誘導体を、選択されたイオンによって検出し、表S1に記載されているような類似の分子構造を有する同位体ISによって定量した。データをQuantAnalysisバージョン2.2(Bruker Daltonics、ブレーメン、ドイツ)を用いて処理し、10個の腸サンプルごとのブラケット検量線を各化合物について得た。検量線は、ISに対するすべての分析物のピーク面積比を検量線標準の濃度に対してプロットすることによって確立された。検量線は、濃度の2乗の逆数(1/x2)の重み付け係数を用いて2次回帰に適合させた。相関係数はすべての回帰において0.98以上であった。回腸試料では、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンのみを定量した。

2.11. 宿主応答の分析

急性期タンパク質であるハプトグロビンを、製造業者の推奨に従って、「PHASE」™ハプトグロビンアッセイ(Tridelta、 Kildare、 Ireland)を用いて、ランダムな順序で血液中の血清中で測定した。マイクロタイタープレートを、マルチラベルプレートリーダー(VICTOR™ ×3、PerkinElmer、MA. サンプルは二重に測定し、濃度は標準曲線から計算した。

血清中のIL-6のレベルは、特定のサンドイッチELISAキット(ラット)(Cusabio Biotech)と450 nmのマイクロプレートリーダー(BioTek)を使用して、製造業者の推奨に従って0.312 pg/mLから 20 pg/mLの間の検出範囲で、ランダムな順序で定量した。

2.12. 統計解析

すべての統計解析は、GraphPad Prism version 7.01 (GraphPad Software、 Inc. CA)またはR (version 3.1.0) (R Core Team、 2013)を用いて行った。治療群間の差異は、分散が異なることが判明した場合には、非対をなしたt検定またはノンパラメトリックMann-Whitney検定を使用して評価した。腸管区画間の差異は、対をなすt検定またはWilcoxon検定を適宜使用して評価した。相関分析は、スピアマンの順位検定を用いて実施した。すべての統計分析について、0.05未満のp値は有意であると考えられた。属レベルでの細菌群の多重比較については、順列に基づくt-検定を適用した。治療群における芳香族アミノ酸代謝物間の違いを評価するために、Dunnの多重比較後検定を用いたKruskal-Wallis一方向ANOVAが使用された。これらのいずれの場合も、q < 0.05 (Pike、 2011) のしきい値を持つ偽発見率法を使用して多重検定の補正を適用した。代謝物データを LatentiX(バージョン 2.11)(Latent5)にインポートして主成分分析(PCA)を行い、データの品質を評価した。QC サンプルは PCA スコアプロットで緊密にクラスタリングされており、安定したシステムであることを示している。

3. 結果

3.1. 最小抑制濃度

ヒトの腸内細菌叢を代表する細菌群について,最小阻害濃度(MIC)を決定した。BHIとRCMの2種類の異なる栄養豊富な培地を選択したが、いずれも同一の生育条件で全菌株の生育をサポートするものであった。市販の製剤であるGlyfonova®は、グリホサートと比較して溶解性が高いため、試験化合物として使用された。全体的に、試験したすべての細菌種は、5 mg/mL から 80 mg/mL の範囲の両方の生育培地で非常に高い MIC 値を示したが、細菌と培地間では多少のばらつきが見られた(表 1)。

3.2. 芳香族アミノ酸の重要性

グリホサートは芳香族アミノ酸の合成を阻害するため(Geiger and Fuchs、 2002)、我々は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンの混合物を添加した場合と添加していない場合を問わず、ABTG 最小生育培地で大腸菌 ATCC 25922 の MIC 値を測定することで、生育培地中での生物学的利用可能な芳香族アミノ酸の重要性を調査した。芳香族アミノ酸を添加しない場合、Glyfonova® に対する MIC 値は 0.08 mg/mL であった。トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンを50μg/mLまたは500μg/mL添加した培地では、MICはそれぞれ10mg/mLおよび20mg/mLに増加した(データは示されていない)。

生育培地中の芳香族アミノ酸の重要性をさらに調べるために、0.08 mg/mL Glyfonova®(アミノ酸を添加していないABTG培地のMICに相当)を0 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mLまたは100 μg/mLの芳香族アミノ酸ミックスを添加した最小培地で嫌気的に生育させた大腸菌ATCC 25922を用いて、24時間の生育実験を行った。細菌増殖は、1時間毎にOD600として決定した(図1A)。その結果、Glyfonova®の抑制効果は、芳香族アミノ酸を添加することで用量依存的に明らかに緩和されることが明らかになったが、最高濃度でも対照群(Glyfonova®を添加しない場合)と比較して増殖開始までに顕著なラグフェーズが観察された(最大増殖率(傾き)は同等であった)。大腸菌ATCC 25922を増殖させるためには、0.1μg/mLから1μg/mLの芳香族アミノ酸ミックス濃度が必要であった(図1A)。

図1

図1. A)3つの芳香族アミノ酸(チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン)の混合物を異なる濃度で添加した0.08 mg/mL Glyfonova®450 Plusを含むABTGミニマム培地で増殖させた大腸菌ATCC 25922。コントロールはGlyfonova®もアミノ酸も含まない。B-D)(B)0.04 mg/mL、(C)0.08 mg/mLおよび(D)0.16 mg/mLの活性化合物を添加したABTG最小培地での大腸菌ATCC 25922の生育に対するグリホサート、グリホサート-イソプロピルアミン塩、Glyfonova®450 PlusおよびRoundup®の影響。データは平均値として示され、エラーバーはSDを示す。

3.3. 異なるグリホサート製剤の生育阻害への影響

大腸菌 ATCC 25922 を芳香族アミノ酸を含まない最小 ABTG 培地で 24 時間生育させたところ、Glyfonova® は最も強い生育効果を示し、0.04 mg/mL の存在下では明らかにわずかなラグフェーズが観察され(図 1B)、確立された MIC 0.08 μg/mL の濃度では 24 時間の間に完全に生育が阻害された(図 1C)。0.08 mg/mLの濃度では、グリホサートの他のすべての製剤は、対照と比較して初期のラグフェーズの後、24時間の間に大腸菌株の成長をもたらした(図1C)。純粋な形態の活性化合物(グリホサート)は、成長の24時間の間の曲線下面積(0.08μg/mLグリホサート)によって決定されるように、他の3つの製剤と比較して、成長に対する影響が有意に低かった(p<0.01)。試験したすべての製剤は 0.16 mg/mL の濃度で大腸菌 ATCC 25922 を完全に阻害した。

3.4. ラットの短期体重増加に対するグリホサートの効果

グリホサートまたはグリフォノバ®に2週間曝露した後(図2A)、介入期間中のラットの体重増加、または終了時の盲腸重量には、対照群と比較して、いずれの治療群間でも有意差は認められなかった(図2BおよびC)。

図2

図2. A)試験デザイン。動物をペアでケージに入れ、1週間順応させた後、純粋な形態または市販の製剤としてグリホサートを2週間毎日経口投与した。最初の投与前に糞便サンプルを採取し、投与終了時に腸管サンプルと血液サンプルを採取した。b)治療期間中のラットの体重増加。C)終了時の内容物を含む盲腸の体重。D)回腸、盲腸および結腸におけるグリホサートおよび(E)AMPA濃度(μg/g)。F)回腸、盲腸および結腸におけるグリホサートおよびAMPA濃度の間のスピアマン相関分析。各コンパートメントについては、スピアマンrとp値を示す。B-C)のデータは、SDを示すエラーバーを持つ平均として示されている。D-E)のデータは、合計範囲を示すウィスカとボックスプロットとして表示される。

3.5. 回腸、盲腸、結腸におけるグリホサートとAMPAのレベル

経口投与されたグリホサートの濃度と、3 つのすべての腸内コンパートメントで検出されたグリホサートの濃度との間には明らかな用量依存関係が観察され、盲腸と回腸の両方と比較して、大腸コンパートメントが最も高いグリホサート濃度(p < 0.0001)を有していた(図 2D)。対照群の動物の腸管試料中にグリホサートとAMPAの両方が検出されたのは、標準的な動物用飼料中の残留物が低かったためと説明できる(グリホサート:1.0±0.03μg/g、AMPA:0.72±0.12μg/g)。グリホサートは、解剖およびサンプル収集の1日前に最後に経口投与されたため、介入期間中の腸管内のグリホサート/AMPAの実際の濃度は、腸管サンプルで測定された値よりも高かった可能性がある。グリホサートの一次分解生成物であるAMPAは、3つのコンパートメントのすべてにおいてバックグラウンドレベル(CTR群)を超えるレベルで検出されたが、最も低い処理群(GLY5)についての有意差は盲腸でのみ検出された(図2E)。全体的にAMPAの濃度は大腸で最も高く、盲腸、次に回腸の順であった(すべてのペアワイズ比較でp < 0.0001)。3 つのコンパートメントすべてにおいて、同じ動物のグリホサートのレベルと AMPA の濃度との間に有意な相関が見られ(p < 0.0001)、AMPA とグリホサートの比率は、腸管を介して回腸から盲腸を経て結腸へと増加するように見えた(図 2F)。

3.6. 盲腸における糞便pHと短鎖脂肪酸のレベル

介入期間の最終日に採取した試料を用いて糞便中のpHを測定したところ、3群すべての治療群でCTR群に比べて有意に高いpHを示した(図3A)。盲腸中のSCFAsである酢酸、プロピオン酸、酪酸及びリンゴ酸の濃度を測定した(図3B)。酢酸のレベルは、NOVA群の動物では、CTR群に比べて有意に低く(p = 0.01)、GLY50群でも同じ傾向が認められた(p = 0.06)。グリホサートの大腸レベルと糞便pHとの間には強い正の相関が見られた(図3C)が、一方で、AMPAの大腸レベルと糞便pHとの間には弱い正の相関が見られた(データは示されていない)。逆に、糞便中のグリホサートと糞便中の酢酸との間には負の相関が見られた(r = -0.54、P < 0.0001)(図3D)が、これは他のSCFAsでは見られなかった。さらに、糞便pHと盲腸の酢酸濃度は負の相関を示した(r = -0.58、P < 0.0001)。

図3

図3. (A)介入期間後の糞便pHを平均値として示し、SDを示すエラーバーで示した。(B) SCFAs の盲腸内濃度(酢酸、プロピオン酸、酪酸、胆汁酸)をボックスプロットで示し、ウィスカは全範囲を示す。(C)大腸のグリホサート濃度と糞便pH、(D)盲腸のグリホサート濃度と酢酸濃度の間のスピアマン相関分析。パネル(A-B)で*p < 0.05; **p < 0.01; ****p < 0.0001; #p < 0.1。相関関係(C-D)については、p値とスピアマンrを示している。

3.7. グリホサート曝露後の細菌多様性と群集組成の変化

すべての動物群において、観察種数(OTUs)およびシャノン多様性指数は、盲腸および結腸に比べて回腸で低かった(図4AおよびB)。また、盲腸と大腸では、NOVA群の方が対照群に比べてOTU数が有意に多かった(図4A)。また,盲腸では,NOVA群の方がシャノン多様性指数が高かった(図4B).活性化合物を同じ濃度で処理したGLY50群とNOVA群の間では、盲腸と大腸の両方で観察された種の数に有意な差が認められ(図4A)、また、グリホサートのin situ測定値に基づいてα多様性に対する活性化合物(GLY5群とGLY50群)の影響は観察されなかった(図4C)。全体的に、すべてのコンパートメントにおける細菌群集は、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteriaに属するクラスによって支配されていた。クラスレベルでの細菌組成物は、テストされた3つのコンパートメント(回腸、盲腸および結腸)のいずれかで治療群と対照群との間の違いを明らかにしなかった、また、介入前の糞便細菌群集で観察された違いはなかった(図4D)。処置群と対照群の間の差異を属レベルで分析すると、複数比較を補正した後、2つの有意に異なる豊富な属、すなわちClostridium sensu strictoとRuminococcusのみが示されたが、そのうちの前者は介入前のCTR群とNOVA群の間で異なることが判明した(図4E)。介入前のCTR群とNOVA群では、群集組成に大きな違いが見られた(図4E)。

図4

図 4. (A) 各群・区画の観察種数(OTU)と(B) シャノン多様性指数を平均値で示し、エラーバーはSDを示す。パネル(A-B)では、*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. C)グリホサート濃度と盲腸で観察された種の数との間の相関分析。D)糞便(t0:介入前)、回腸、盲腸、結腸のクラスレベルでの平均細菌組成。全サンプルにわたって有病率が25%未満の細菌クラスと、少なくともクラスレベルに分類されていない細菌群を集計した。その他。(E) 動物の各グループの糞便(介入前)、回腸、盲腸および結腸における属名の平均相対的な豊富さをそれぞれ示すヒートマップ。色は行のzスコアを示す。示されている細菌属は、任意の単一サンプル中の群集の1%以上を表し、すべてのサンプルの少なくとも25%に存在している。対照群と処置群の間の有意差は、*q < 0.05(FDR補正順列法に基づくt検定)として示されている。左側のカラーバーは、細菌属の分類を示す(黄色。アクチノバクテリア、赤。Bacteroidetes、シアン:バチルス(Firmicutes)、青。緑:クロストリジア(Firmicutes)、緑:エリシペロトリキア(Erysipelotrichia)、赤:バクテロイデス(Bacteroidetes)、シアン:バチルス(Firmicutes)、青:クロストリジア(Firmicutes)、緑:クロストリジア(Firmicutes 緑:Erysipelotrichia(Firmicutes)、紫:Erysipelotrichia(Firmicutes)。(この図の凡例の色の解釈については、この記事のウェブ版を参照してほしい)。

3.8. 芳香族アミノ酸と代謝プロファイリング

グリホサートはシキメート経路を阻害することが知られているため(Geiger and Fuchs、 2002)、3 種類の芳香族アミノ酸(チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン)とその誘導体の大腸内濃度を測定した(図 5A)。投与群にかかわらず、3種の芳香族アミノ酸のすべての濃度が最も高いのは回腸であった(図5B-D)。チロシンとフェニルアラニンの両方の濃度は、盲腸では大腸よりも有意に低く、トリプトファンにもその傾向が見られた(図5B-D)。芳香族アミノ酸のチロシンについては、NOVA群(GLY50群ではなかった)では、CTR群と比較して回腸のチロシン濃度に単一の有意差が認められた。多重試験を補正した後の盲腸および結腸で決定された下流代謝物のいずれについても、治療群と対照群との間に差は認められなかった(図5E)。

図5

図5. (A) グリホサートが腸内の芳香族アミノ酸の代謝に及ぼす影響の概要。下線部は本研究で対象とした代謝物である。CTR、GLY5、GLY50およびNOVAを投与した群の回腸、盲腸および結腸における(B)チロシン、(C)フェニルアラニンおよび(D)トリプトファンの濃度を示す。データは、完全な範囲を示すウィスカを持つボックスプロットとして示されている。パネルでは(B-D)*p < 0.05; ****p < 0.0001。E)盲腸および結腸における芳香族アミノ酸および誘導体の平均濃度(zスコア)を示すヒートマップ、総称して。多重検定で補正した後の代謝物のいずれについても、CTR群と治療群との間に差は認められなかった。

3.9. 血清中のハプトグロビンおよびIL-6レベル

血清IL-6のレベルは、いずれの治療群においても、CTR群と比較して差は認められなかった(図6A)。急性期タンパク質ハプトグロビンの血清レベルは、NOVA群において、CTR群と比較して有意に高かった(図6B)。

図6

図6に示すように、CTR、GLY5、GLY50、NOVAを投与したラットの血清中の(A)IL-6および(B)ハプトグロビンの濃度を示す。CTR、GLY5、GLY50およびNOVAの治療群のラットからの血中血清中の(A)IL-6および(B)ハプトグロビンの濃度。データは、SDを示すエラーバーを持つ平均として示されている。*p < 0.05.

4. 議論

腸内環境に関連する特定の細菌株のグリホサートに対する試験管内試験(in vitro)感受性(表1)は、他の研究者が以前に報告したよりも高いMIC値を示した(Clair et al 2012年、Shehata et al 2013)。しかし、我々の結果は、細菌群によってグリホサートに対する感受性が異なるというこれまでの知見をある程度裏付けるものであった。

具体的には、Bacteriodes と Bifidobacterium に属する種の方が大腸菌よりも市販のグリホサート製剤に対して感受性が高いことがわかったが、観察された差は以前に報告されたものよりもはるかに小さかった (Shehata er al 2013)。

研究間の相違は、様々な増殖培地や増殖条件、グリホサートの異なる製剤の使用に起因する部分もあるかもしれない。

この研究では、Polyethoxylated tallow amine (POEA)を使用していない製剤を使用したが、これは Shehata ら (2013) による研究では細菌に対する効果が増加した可能性がある化合物であった。

さらに、以前に報告されたものと比較して、本研究で観察された非常に高いMIC値は、シキメート経路の冗長性のために、グリホサートに対する細菌の感受性を緩和することが示されている(Gresshoff、 1979、 Haderlieら、 1977)遊離芳香族アミノ酸を高レベルで含む増殖培地の使用を反映している可能性がある。

これを裏付けるように、大腸菌ATCC 25922は、アミノ酸を添加していない最小限の培地では、豊富な生育培地よりも有意に低いMIC値(0.08 mg/mL)を示した。これは、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンの3つの芳香族アミノ酸を添加すると、用量依存的にグリホサートの阻害効果が減少し、増殖培地中の0.1μg/mL以下の芳香族アミノ酸では増殖が検出されなかったことを示した24時間増殖実験によってさらに裏付けられた(図1A)。

農業への適用のために市販されている活性化合物グリホサートは、ほとんどがイソプロピルアミン(IPA)塩として配合されているが、ジアンモニウム、カリウム、トリメシウム、セスキソジウムなどの他のカチオンも使用されている(Lee er al)。 さらに、水への溶解性や植物への取り込み性を高める添加剤を使用してもよい。

本研究で得られた試験管内試験(in vitro)の結果は、グリホサートの異なる製剤が細菌に異なる影響を与える可能性があるという考えを支持するものである。我々は、同じ活性化合物濃度0.08 mg/mLに曝露した場合、純粋なグリホサートは、グリホサートIPA塩、市販の製剤であるGlyfonova®およびRoundup®の両方よりも、大腸菌の生育に対する影響が有意に低いことを発見した(図1C)。しかし,この濃度の半分(0.04 mg/mL)では,いずれの製剤も生育への影響はほとんど認められなかった(図1B)。

 

グリホサートの腸内細菌に対する生体内試験(in vivo)効果を調べるために、グリホサートを2週間毎日経口投与した動物モデルを適用した。比較的短い曝露期間は、抗菌性化合物に対する微生物相の予想される速い応答を反映している(Tulstrup et al 2015)。5倍および50倍ADIへの動物の曝露は、除草剤の現在の閾値を評価するために、それぞれ選択した。

全体的に、いずれの腸内コンパートメントにおいても、GLY5およびGLY50群を対照群と比較した場合、α多様性および細菌群集組成に対する活性化合物の影響は見出されなかった(図4)。生体内での腸内細菌群集の変調の欠如は、おそらく、シキメートを部分的にブロックする効果を緩和するのに十分なレベルの腸内芳香族アミノ酸の存在によって引き起こされる。

これは、芳香族アミノ酸のバイオアベイラビリティがおそらく低く、グリホサートが細菌群集組成のシフトを引き起こすことが実証されている土壌環境の状況とは異なるようである(Newman et al 2016)。実際、ゲノム調査から得られた証拠がこの見解を支持している。

土壌環境中の自由生息細菌のほとんどが完全で機能するシキメート経路を含んでいるように見えるのに対し、腸内環境中の宿主関連細菌では、4分の1以上が不完全な経路を有しており、十分な量の芳香族アミノ酸を利用できるため、原生合成にエネルギーを費やす必要がないことを示唆している(Zucko et al 2010)。

 

腸内に十分な量の芳香族アミノ酸が存在することを確認するために、回腸、盲腸、結腸のチロシン、フェニルアラニン、トリプトファンの濃度を測定した。3つのアミノ酸すべての濃度が最も高いのは回腸であったが、より低い濃度は盲腸および結腸で検出された(図5B-D)、

これは小腸で予想されるアミノ酸の取り込み(Stevens et al 1984)と一致する。グリホサート処理動物(GLY5およびGLY50)と対照動物との間には、いずれの腸内コンパートメントにおいても違いは見られなかったが、回腸におけるチロシンのわずかに高いレベルがNOVA群で見られた。

さらに、下流のグリホサート代謝物のいずれにも群間での差は認められなかった(図5E)。このように、(i)与えられた用量のグリホサート処理は、腸内環境における芳香族アミノ酸レベルに顕著な影響を及ぼさず、(ii)一般的には、少なくとも大腸菌が他の腸内細菌の代表である場合には、影響が期待できないレベルの濃度であるように思われる(図1A)。

しかし、同一処理群内の動物の盲腸・大腸内の芳香族アミノ酸濃度は10倍以上の幅があり(図5B-D)、動物によってはグリホサートによる細菌の増殖抑制を可能にするには十分な低濃度である可能性があることがわかった。

 

特定の属間の差は検出されなかったが、我々は、細菌群集のα多様性が、OTUリッチネスおよびシャノン多様性指数の両方の観点から、グリフォノバ®で処理した後に、わずかではあるが有意に増加したことを発見した(図4AおよびB)。

このような効果は、グリホサートが腸内で抗菌剤として機能していることとは一致しておらず、これは通常、α多様性の低下をもたらす(Tulstrup et al 2015)ためであり、また、活性化合物の濃度が同じGLY50群でも同様であったと予想されるであろう。

したがって、Glyfonova®製剤は、観察された群集を豊かにするために、他の細菌栄養源を含んでいる可能性がある。また、Glyfonova®に細菌のDNAが混入している可能性も考えられたが、製品に細菌汚染物質が含まれていないことが確認された。

 

グリホサートまたはGlyfonova®の50倍ADIで処理しても細菌群集の組成に大きな変化は見られなかったが、糞便pHおよび盲腸の酢酸濃度には処理群間で有意な差が見られ(図3AおよびB)、大腸のグリホサートと糞便pHの間には強い相関関係が見られた(図3C)。

平均酢酸濃度は、対照群と比較してNOVA群で有意に低く、GLY50群でもその傾向が認められた。これは、グリホサート処理中に観察されたpHの上昇を少なくとも部分的に説明することができ、盲腸におけるグリホサートと酢酸との間に観察された負の相関関係と一致している(図3D)。

 

細菌によるSCFAsの産生は、細菌-宿主相互作用において重要な役割を果たし、エネルギー調節、食欲、および宿主免疫調節に影響を与えるので、これらの観察は興味深いものである(Comalada et al 2006年、Fukuda et al 2011)。SCFAsはまた、大腸水の吸着に影響を与え、糞便pHを低下させることにより、大腸内の細菌群集に影響を与える可能性がある(den Besten et al 2013)。

我々は、通過時間および群集組成に関連する糞便の一貫性(データは示されていない)において、治療群間の差を見いだした(Roager et al 2016)。興味深いことに、ピレスロイド系殺虫剤ペルメトリンのラットの糞便微生物叢への影響についての最近の調査でも、酢酸を含むSCFAsのレベルの変化、およびBacteroidetesの減少およびEnterobacteriaceaeおよびLactobacillusの増加を含む微生物叢組成のさらなるシフトが明らかにされた(Nasuti er al)。、 2016)。

著者らは、腸内環境に関連する細菌および酵母種に対するペルメトリンのMICを決定し、0.4~3.2μg/mLの範囲の値を示したが、これは本研究でグリホサートに対して決定された値よりもはるかに低い値であった。

 

グリホサートを投与したラットの臓器には生理的異常は認められなかった。しかし、グリフォノバ®を投与したラットでは、急性期タンパク質であるハプトグロビンの血清中濃度がわずかに上昇したが、同濃度の純粋なグリホサートでは上昇しなかった。

このことから、この反応は製剤中の添加物によるものである可能性が示唆され、さらなる調査が必要である。しかし、急性期タンパク質を誘導することが知られている血清IL-6のレベルには、グリフォノバ®の影響は見られなかった。

 

結論として、純粋なグリホサートおよび試験済みの市販製剤であるGlyfonova®は、ヒト用濃度50xADIで2週間の経口曝露試験において、ラットの腸内微生物群集組成に対する影響が非常に限定的であることが示された。

これは、腸内環境における芳香族アミノ酸の十分なバイオアベイラビリティーが、グリホサートがシキメート経路を遮断する効果を緩和することによって説明されると思われる。

しかし、ヒトの栄養不良の場合や、腸内で利用可能なアミノ酸のレベルを低下させる可能性のある特別な(例えば低タンパク質の)食事を摂取している被験者の場合には、グリホサートの有害な影響を排除することはできない。

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