SARS-CoV-2スパイク蛋白質におけるD614G変異の機能的重要性

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Functional importance of the D614G mutation in the SARS-CoV-2 spike protein

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33220921/

2020年11月20日

要旨

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、細胞受容体アンジオテンシン変換酵素2(ACE2)と結合し、ウイルス表面に表示されるスパイク(S)糖タンパク質の作用により宿主細胞に侵入するエンベロープ型ウイルスである。

SARS-CoV-2の基準株と比較して、現在流通している分離株の大部分は、アミノ酸位置614(D614G)のアスパラギン酸からグリシンへの置換によって特徴づけられるSタンパク質の変異体を有している。残基614は受容体結合ドメイン(RBD)の外側にあり、この変異はACE2に対する単量体Sタンパク質の親和性を変化させない。しかしながら、S(D614)と比較して、S(G614)は、S-擬型ベクターによる細胞のより効率的なACE2介在性導入を媒介し、生きたSARS-CoV-2による細胞および動物のより効率的な感染を媒介する。

本レビューでは、D614Gスパイク変異の疫学的および機能的観察を、この変異の生化学的および細胞生物学的影響とSタンパク質機能への影響に焦点を当てて要約し、まとめている。さらに、現在の世界的なパンデミックとの関連において、これらの最近の知見の意義について考察する。

キーワード

SARS-CoV-2COVID-19スパイクタンパク質

1. 序論

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、COVID-19パンデミックの原因菌である。SARS-CoV-2は、エンベロープ型のポジティブセンス一本鎖RNAウイルスで 2003年に出現したSARS-CoV(ここではわかりやすくするためにSARS-CoV-1と呼ぶ)と遺伝的に類似していることから命名された。SARS-CoV-1およびSARS-CoV-2は、いずれもベータコロナウイルス属に属し、ヒトコロナウイルス(HCoV)-OC43,HCoV-HKU1,中東呼吸器症候群関連コロナウイルス(MERS-CoV)と共通の分類である。これらのヒトベータコロナウイルス属のうち,79%の塩基配列同一性を有するサルベコウイルスSARS-CoV-1とSARS-CoV-2のみが標的細胞への侵入にアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に依存している[2][3][4][5][6]が,2003年にSARS-CoV-1の受容体として同定された[7].興味深いことに、遠縁のヒトアルファコロロナウイルスNL-63もまた、ACE2をその主要な受容体として利用している[8]。受容体の結合および細胞内への侵入に必要なスパイク(S)糖タンパク質は、三量体の形でウイルス上に表示される。これらのSタンパク質三量体は、電子顕微鏡によるウイルスの冠状の外観を生み出している[9]。SARS-CoV-1およびSARS-CoV-2のSタンパク質は、いずれもACE2受容体への結合を担うN末端のS1サブユニットと、細胞融合に必要なC末端の膜貫通型S2サブユニットから構成されている[10]。S1内の受容体結合ドメイン(RBD)は、ウイルスが標的細胞に関与する際にACE2と相互作用する[[11], [12], [13], [14]]。SARS-CoV-1の侵入時には、S1とACE2の相互作用に続いて、S1/S2境界の切断部位が標的細胞表面のTMPRSS2などのプロテアーゼによって、またはリソソソームカテプシンによって処理され、膜融合活性を促進する[[15], [16], [17], [18], [19], [20]]。SARS-CoV-1や他のすべての動物性サルベコウイルスとは対照的に、SARS-CoV-2のSタンパク質は、S1とS2サブユニットの接合部に多塩基切断部位を獲得しており、これはウイルス産生細胞内でフーリン様プロ蛋白質変換酵素によって処理される [21]。このように、HIV-1や一部のインフルエンザAウイルスの侵入タンパク質のように、Sタンパク質は標的細胞に遭遇する前に切断される。したがって、S1をウイルス上に保持するためには、S1とS2の間の分子間会合が必要である。SARS-CoV-1およびSARS-CoV-2の両方において、S2の内部の部位で2回目の切断が行われ、S2’として知られるフラグメントが得られ、標的細胞との膜融合にも必要である[[21], [22], [23]]。

侵入プロセスにおけるSタンパク質の明らかな重要性のため、その機能を詳細に研究するための多くのツールが開発されていた。レンチウイルス、ガンマレトロウイルス、または小胞性口内炎ウイルス(VSV)ベクターをベースとした疑似ウイルス(PV)システムは、CoVのSタンパク質でコーティングされており、SARS-CoV-2の侵入を理解する上で急速な進歩を遂げている。PVは完全長のSタンパク質で疑似型化することができるが、C末端の切り捨ては、SARS-CoV-1およびSARS-CoV-2のSタンパク質を疑似ウイルスに組み込む効率を向上させるためにしばしば観察されている[[24], [25], [26]]。疑似タイピングを向上させるために非ネイティブなシグナル配列を置換することも、他のウイルス侵入タンパク質での観察に基づいていくつかのグループによって採用されてきたが、SARS-CoV-2 Sタンパク質の最近のサイドバイサイド比較では、ネイティブと最適化されたシグナルペプチドの間に違いは観察されなかったが[27]。一般的に、実験的証拠は、SARS-CoV-2 Sが介在するACE2発現細胞への侵入は、SARS-CoV-1 Sが介在するものよりも効率的ではなく、TMPRSS2への依存性が高いことを明らかにしている[28,29]。これは、特にSARS-CoV-2 SのRBDはACE2に対する親和性が高いが、SARS-CoV-2のACE2結合親和性がSARS-CoV-1スパイクトリマーに比べて低いことと一致している[14]。

コロナウイルスおよびニドウイルス目の他のメンバーは、RNAウイルスの中で知られている最大かつ最も複雑なゲノムを維持しており、コロナウイルスの複製は、劇症的な突然変異の蓄積を避けるために、NSP14のエキソヌクレアーゼのプルーフリーディング(校正)活性を利用している[30]。このような独特の高い複製の忠実度にもかかわらず、COVID-19パンデミックの現在の過程では、S遺伝子を含め、SARS-CoV-2ゲノムに対する多くの変異が観察されている。実際 2020年6月に分離された3090株の分析では、Sのユニークな対立遺伝子の数が他の構造遺伝子であるM、N、およびEよりも多いことが判明し、Sの変化が進化的利益をもたらす可能性があることを示唆している[31]。特にS遺伝子の1つの非同義変異、アミノ酸位置614のアスパラギン酸-グリシン置換(D614G)は、疫学的サーベイランスによって発見されたその濃縮の報告を受けて、大きな注目を集めている[32]。最初の反応では、この変化の機能的関連性と、その優勢がフィットネスの優位性によるものなのか、それとも創始者効果によるものなのかが疑問視されていた[[32], [33], [34]]。さらなる研究では、S(G614)とS(D614)の偽型を持つPVが感染力を高めたという我々自身の観察を含め、D614Gによってもたらされる明確な表現型的優位性が実証されている[35]。この感染力増強の正確なメカニズムについてのコンセンサスはまだ得られていない。しかし、この分野での継続的な研究により、その姿はますます明らかになってきている。本レビューでは、D614G突然変異に関するこれまでの研究をまとめ、発表された研究やプレプリントで入手可能な未査読の原稿を含むことを目的とする。

2. SARS-CoV-2のS(G614)遺伝子型は、世界的にS(D614)遺伝子型に取って代わられた。

D614G変異への最初の注目は、「早期警戒」バイオインフォマティクスパイプラインを用いたKorberらのプレプリントによって促された。S(G614)遺伝子型を持つSARS-CoV-2は 2020年1月下旬に初めて検出され 2020年3月には世界的な罹患率が着実に増加し、S(D614)ウイルスと比較して優勢な型となるように出現し始めた(図1)[32]。研究者らはまた、S(G614)ウイルスに感染した患者では、S(D614)ウイルスに感染した患者と比較して、約3倍のウイルス負荷が高いことにも注目している。S(G614)の表現型に対する明確な機能的証拠が最初は存在しなかったため、他の方法論を用いた独立した疫学的解析では、D614G突然変異は伝染性の優位性をもたらさないと結論づけられた[33]。しかし、この突然変異への注目が高まるにつれ、Korberらの最初の主張を支持する多くの研究が報告されてきた。S(G614)遺伝子型が優性であるヨーロッパ諸国の感染データを解析したところ、倍化時間は約3日と推定されており[37]、中国で発生した当初の倍化時間6日よりも有意に短い[38]。また、ある地域におけるS(G614)の有病率とその地域の症例死亡率との間には、わずかではあるが有意な正の相関関係が報告されている[39]。別のグループでは、統計的には有意ではないが、同様の傾向が観察されている[40]。さらに、進化ダイナミクスの計算モデルは、D614Gが強い選択的圧力を受けていることを示唆している[31]。さらに、感染発生率データからの基礎再生産数R0の定量的な推定値は、S(G614)を持つウイルスは、S(D614)を持つウイルスよりも31%多く感染することを示唆しているが、この解析では、循環するウイルス株の他の遺伝子座の同時変化の影響は考慮されなかった[41]。様々な研究では、スパイクのD614G変異と一緒に他のウイルス遺伝子の変化の共沈が確認されており、例えば、ウイルスポリメラーゼRdRpのP323L変異のように、D614Gウイルスの増加した伝染性を補うために複製を減衰させる可能性がある[40,42,43]。

図1. D614またはG614 S遺伝子を有するSARS-CoV-2の累積報告配列

表示された日付の量は、Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GSAID)のデータを利用した、Los Alamos National Laboratory (https://cov.lanl.gov/content/sequence/TRACK_MUT/trackmut.html)が主催するCOVID-19 Viral Genome Analysis Pipelineから取得したものである。


3. D614G突然変異は、疑似ウイルスや生きたSARS-CoV-2の感染性を高める。

S(G614)を表示するPVによる侵入の促進は、現在、多くの異なるモデル系で実証されており、標的細胞の種類、シュードタイピング系、感染手順などの実験条件に応じて、S(D614)の約2.5倍から45倍の範囲である。同等のコピー数では、S(G614)とS(D614)を偽型化したGFPレポーター発現マロニーマウス白血病ウイルス(MLV)は、ACE2過剰発現HEK293T細胞(TMPRSS2過剰発現の有無にかかわらず)およびACE2過剰発現NCI-H1975ヒト肺上皮細胞において、有意に高いトランスダクションをもたらした [35]。S(G614)を担持したレンチウイルスPVによるトランスダクションの促進は、ACE2-過剰発現、ACE2-およびTMPRSS2過剰発現HEK293T細胞[25,28,32,39,40,44,45]、ACE2-過剰発現A549ヒト肺上皮細胞[39]、ACE2-過剰発現Huh7.5ヒト肝細胞[39]でも観察されている。 5ヒト肝細胞[39]、Caco-2ヒト結腸上皮細胞[39,44]、およびCalu-3ヒト肺上皮細胞[44]。同様に、S(G614)で偽型化されたVSV PVは、Vero細胞、ACE2過剰発現HEK293T細胞、およびACE2およびTMPRSS2過剰発現HEK293T細胞をより効率的に感染させた[32,45]。ウイルス感染性におけるD614G変異の影響は、TMPRSS2過剰発現の有無にかかわらず、また、Sタンパク質細胞質ドメインの改変、すなわち全長またはC末端切断Sタンパク質の改変にかかわらず、持続的であった [35,40,45]。Michaudらによる研究は、定量的に焦点を当てたアプローチにより、D614Gに関する観察をさらに強化した。ドキシサイクリン誘導性ACE2発現HEK293T細胞株を用いて、研究者らは、ACE2発現レベルの広い範囲において、S(G614)レンチウイルスPVがS(D614)PVよりも効率的なトランスダクションを媒介することを観察したが、これは、受容体を豊富に発現する安定細胞よりも、生理学的に関連する細胞タイプの代表的なものであると主張している[25]。同じグループはまた、2色レポーターシステムを用いて、ACE2過剰発現HEK293T細胞において、GFP発現S(G614)PVがRFP発現S(D614)PVに勝ることを観察した。S(D614)とS(G614)のPV比の範囲での共導入は、RFP発現ベクターとGFP発現ベクターの両方をS(D614)で仮性化したコントロールと比較して、RFP発現細胞よりもGFP発現細胞の割合が高いことを一貫して示した[25]。

PVシステムからのD614G効果の最初の観察は、現在、細胞培養および動物モデルにおける生きたSARS-CoV-2を用いて実証されている。Daniloskiらは、HEK293T細胞をACE2とS(D614)またはS(G614)のいずれかでトランスフェクションした後、S(D614)を有するSARS-CoV-2に感染させるトランスコンプリメンテーションアッセイを開発した。研究者らは、S(G614)をトランスフェクションした細胞でウイルス複製が有意に増加したことを観察したが、これは、これらの細胞で産生された子孫ウイルスが外因的に供給されたS(G614)を組み込んだためであろう[39]。Mokらは、3つの生のSARS-CoV-2分離株、2つのS(D614)を用いたもの(HK-8およびHK-13)と1つのS(G614)を用いたもの(HK-95)のハムスターにおける感染性を比較した。HK-95感染ハムスターと同居したナイーブハムスターでは、HK-8またはHK-13感染ハムスターと同居したナイーブハムスターと比較して、肺および鼻濁液中に有意に高いウイルス力価が観察された [46]。これらの知見は、Sタンパク質のD614Gバリアントが哺乳動物におけるウイルスの伝染性を促進するという仮説を支持するものである。しかし、この研究で使用されたウイルスは等原性ではないため、他の遺伝的差異が観察された感染性に寄与している可能性があることを考慮しなければならない。この限界に対処するため、Planteらは感染性cDNAクローンを用いて、S(D614)またはS(G614)を有するSARS-CoV-2の等原性を発現させた[47]。研究者らは、Calu-3ヒト肺上皮細胞に感染すると、G614ウイルスの複製が増加することを観察した[47]。この効果は、ヒト初代気道培養物でも実証された。さらに、競争実験では、PVシステムで見られた結果と同様の結果が得られた;9倍以上のD614ウイルスを共接種した場合でも、G614ウイルスは初代ヒト気道細胞で優勢でした[47]。シリアハムスターにG614ウイルスを感染させた場合も、鼻組織での複製が有意に増加し、鼻、気管、肺組織での感染性(PFUとRNAの比率)が比較的高いウイルスが得られたが、統計的に有意な差が得られたのはほんの一握りの条件と時間点のみであった[47]。

Houらは、独自に開発した逆遺伝学的システムを用いて、ルシフェラーゼレポーターとS(D614)またはS(G614)をコードする等原性SARS-CoV-2クローンを作製した。Planteらの知見と一致するように、S(G614)による感染の促進は、Vero-E6細胞、Huh7細胞、およびACE2を過剰発現するA549細胞で観察された [48]。同様に、D614とG614ウイルスの両方に感染した初代大気道上皮細胞では、D614ウイルスが10倍以上の量の接種を開始した場合でも、3回の継代でG614ウイルスが優勢になった[48]。同じ研究者はまた、G614 SARS-CoV-2に感染したヒト初代鼻上皮細胞および大気道上皮細胞への感染は、等量の等原性D614ウイルスに感染したものよりも有意に高い力価をもたらしたことを観察した[48]。しかし、この効果は小気道上皮細胞では見られなかった。同じ等原性ウイルスを用いてシリアのハムスターを感染させたところ、G614ウイルスに感染したハムスターでは、肺組織および鼻組織でのウイルス力価は同様であったが、D614ウイルスに感染したハムスターと比較して、体重減少が適度に大きくなることが観察された。重要なことは、直接接種しても D614G 変異の影響は認められなかったが、G614 ウイルスは感染したハムスターからナイーブなハムスターへの伝達性が著しく高かったことである。2日間の曝露後、G614ウイルスに感染したハムスターに曝露されたハムスター8匹中5匹が検出可能な感染とウイルス脱離を示したのに対し、D614ウイルスに感染したハムスターに曝露されたハムスター8匹中0匹が同じ時点で検出可能な感染を示した [48]。

4. D614G効果の分子機構は不完全に解明されていない

D614G変異がSARS-CoV-2およびS-偽型ベクターの感染性をどのように増加させるのかを明らかにするために、これまでに多くの研究が行われてきた。D614G変異はSタンパク質の切断効率を調節する、RBD-ACE2との相互作用に有利なコンフォメーションを促進する(”openness “仮説)Sタンパク質のウイルスへの取り込みをより効率的に行う(”density “仮説)プレフュージョンスパイクトリマーの結合を安定化させる(”stability “仮説)などである。独立した研究では、表面プラズモン共鳴[35]またはバイオ層干渉計[39]によって測定されたS(D614)とS(G614)のモノマーはACE2に対して同様の親和性を持つことがわかっている。他の研究では親和性の変化が報告されているが[44,49]、研究で使用されたSタンパク質の性質に応じて、データを解釈する際には注意が必要である。可溶性スパイクトリマーが使用されている場合、ACE2の結合は親和性だけでなく、S1の脱落によっても決定される。一方、furin-null変異を含む可溶性スパイクトリマーを使用した場合、この変異はS1-sheddingの問題に対処するが、D614とG614の間の差はもはや観察されないかもしれない。

図2. D614G変異スパイクを持つSARS-CoV-2分離株による感染性の増加を説明する2つの独立したモデルの比較

左側の「開放性」モデルでは、S(G614)スパイクがACE2とRBDとの相互作用に必要と考えられる1-up構造をとる傾向が強くなることで、感染性の増加を説明している。マゼンタ、青、緑の色は、個々のSタンパク質モノマーを示す。黄色のアスタリスクは、S1/S2界面付近の残基614の位置を示す。右側では、”密度安定性 “モデルは、S(G614)スパイクトリマーの安定性の増加によって感染性の増加を説明し、ウイルスへの取り込みを促進し、S1サブユニットの脱落を減少させる。(この図の凡例の色への参照の解釈については、読者はこの記事のWeb版を参照してほしい)。

4.1. Sタンパク質の切断を調節する

Bhattacharyyaらは、in silico予測を用いて、D614G置換がエラスターゼの開裂部位を導入することを提案した[50]。別のグループは、プロテアーゼ開裂部位の予測のために独立したソフトウェアツールを使用し、D614G置換によって導入されたのと同じ新規開裂部位を同定した[51]。その研究では、Sタンパク質を過剰発現させたHEK293T細胞の細胞溶解物ウエスタンブロットを行ったところ、S(G614)をトランスフェクションした細胞では、S(D614)をトランスフェクションした細胞よりも強いS1対完全長Sシグナルを示し、さらにエラスターゼ阻害剤であるsivelestatがS1バンド強度を有意に減少させることが観察された[51]。しかし、sivelestatもまた、S(D614)の文脈でS1強度をわずかに減少させるようであり、細胞溶解液中のスパイクの観察は成熟したウイルスのそれを代表するものではないことに注意しなければならない。独立したグループはさらに、S(D614)と比較してS(G614)ではフーリン部位でのプロテアーゼ切断がより効率的であることを観察している[52]。一方、Daniloskiらは、S(D614)と比較してS(G614)は、細胞溶解物中の未開裂Sの量と試験管内試験でのフーリン消化時の量によって決定されるように、S(D614)と比較して開裂に対する耐性が高いことを観察した[39]。

4.2. 開放型RBDコンフォメーションの促進

Mansbachらは、分子動力学シミュレーションを行うことで、D614Gの突然変異がプロトンマー内のエネルギーの変化に影響を与え、スパイク三量体の「ワンアップ」構造、つまり3つのプロトンのうちの1つがオープン構造になることを予測した。この「ワンアップ」の状態は、全閉状態のスパイク三量体はRBDをACE2に曝露しないため、感染可能な状態と考えられており、逆に2つまたは3つのプロトンマーが同時に開いている状態は不安定である[54]。さらに、グローバル差分接触解析を適用することで、CT1-CT2(528-685)領域とFP-FPR(816-911)領域の接触がこの効果の主な要因であり、特にD614-T859水素結合の廃止がこの効果に寄与していることがわかった[54]。これらの相互作用は他のグループによっても示唆されている[28,32,55,56]。独立した分子動力学シミュレーションはまた、S(G614)変異体がオープンコンフォメーションを好むという仮説を支持しており、特にD614G変異は、クローズドコンフォメーションでのプロトンマー間D614-K835塩橋の形成を阻害することを示唆している[40]。これらの主張を裏付ける実験データは、クライオ電子顕微鏡(EM)[44]やネガティブステインEM[57]による精製スパイク三量体の評価で報告されている。どちらの方法でも、S(G614)スパイクではオープン状態がより多く存在するのに対し、RBD-ACE2との相互作用に不利と考えられるスリーダウン状態では、S(D614)スパイクの割合が有意に高いことが観察された。両研究の大きな違いは、WeissmanらのネガティブステインEMデータでは、G614スパイクの84%が “ワンアップ “コンフォメーションで、残りのスパイクは “スリーダウン “コンフォメーションで観察されたことである[57]。両方の研究の限界は、Sタンパク質の構築物は、furin-null変異と前融合コンフォメーションを安定化するために残基986-987のジプロリン変異を持っていたことである[44,57]。そのため、解析された高分子構造は切断されておらず、加工されたSタンパク質三量体のS1とS2の間の分子間結合に及ぼすD614Gの影響を確認することはできなかった。Gobeilらは、furin-null変異を維持したまま、ネイティブのK986残基とV987残基を用いてスパイクエクトドメインの構造を研究し、D614スパイク三量体はジプロリン変異の有無にかかわらず、同様の融解温度を有することを発見した[52]。S(D614)とS(G614)スパイクの低温電子顕微鏡構造は、ジプロリン変異を欠いたS(D614)とS(G614)スパイクの “two-up “または “three-up “コンフォメーションの集団を同定しなかったが、S(G614)では “one-up “コンフォメーションの富化を示している[52]。

4.3. より高いSタンパク質のウイルスへの取り込みを促進する

我々は、SARS-CoV-2核タンパク質(N)、膜タンパク質(M)、エンベロープタンパク質(E)、S(D614)またはS(G614)からなるウイルス様粒子(VLP)を作製した。ウェスタンブロットにより、同数のVLP粒子を解析し、その量をNタンパク質のバンド強度で確認したところ、S(G614)を含むVLPは、S(D614)を含むVLPに比べてSタンパク質の組み込み密度が有意に高いことがわかった[35]。また、S(D614)と比較して、S(G614)のMLV PVへの組み込みが高いことも確認された。逆に、いくつかの研究では、レンチウイルスPVまたは生きたSARS-CoV-2を用いて、スパイク密度に対するD614G変異の影響は観察されなかった[44,47,48]。細胞毒性は、少なくとも部分的にはこの明らかな矛盾を説明することができる。有意な細胞毒性は、ライブSARS-CoV-2感染と同様に、レンチウイルスおよびVSV PVの産生に関連している。対照的に、MLV PVの産生は全く細胞毒性を示さないのに対し、SARS-CoV-2 VLPの産生、特にMタンパク質の発現は毒性を示すことがわかった[35]。これらの細胞毒性系の場合、溶解した細胞から放出されたSタンパク質が、ウイルス上のSタンパク質密度の違いを覆い隠している可能性がある。一つの注意点は、走査型EMおよび透過型EMによる等原性D614およびG614変異体SARS-CoV-2の可視化は、スパイク密度の有意差を明らかにしなかったことである[48]が、これは、汚染されたSタンパク質のマスキング効果によって説明できない。多くの研究では、生きたSARS-CoV-2において、Vero細胞内で2~3回の継代でフーリン切断部位の欠失が観察されているため[[58], [59], [60], [61]]、生きたウイルスの研究がこの適応のアーチファクトの影響を受けないように注意を払わなければならない。VLPおよびMLV PVに関する我々自身の観察と一致して、Turonovaらは、生きたSARS-CoV-2 G614ウイルスを低温電子顕微鏡で可視化し、D614ウイルスを用いた先行研究で報告されたよりもはるかに大きなスパイク密度を観察した[61,62]。一貫して、D614G変異に関連したスパイク密度の増加は、ミショーらによってレンチウイルスPVシステムで再現された[25]。研究者らはまた、S(D614)と共発現させた場合、S(G614)が擬ウイルスに優先的に組み込まれること、およびpseduovirions上のキメラスパイク三量体がS(D614)プロトンよりも多くのS(G614)プロトンを含むことも観察した[25]。G614ビリオン上のスパイク密度の増加のための1つの説明は、S(G614)モノマーが安定した三量体を形成するためのより大きな傾向であり、これはビリオンの組み込みのための必須条件である。

4.4. Sタンパク質の安定性を高める

S(G614)の安定性は、D614G変異がS1の脱落を減少させるという観察結果に基づいている可能性が高い。PVとVLP実験モデルの両方を用いた我々の研究では、S(D614)ウイルスと比較してS(G614)ウイルス上でのS1サブユニットのより強い保持が観察された[35]。S1とS2のより強い分子間結合は、Fernándezの生物物理学的解析によってサポートされており、S(G614)ではS1とS2の界面が安定化していることが示唆されている[63]。さらに、S(D614) SARS-CoV-2の感染性を制限する要因として、S1の欠落が考えられる[62]。いくつかの独立した研究により、この仮説を支持する実験データが得られている。Nguyenらは、HEK293T細胞でSタンパク質を単独で発現させ、S(G614)による細胞培養培地へのS1の放出が有意に低いことを発見したが、S(G614)のS1およびS2への処理はS(D614)のそれよりもわずかに高いだけでした[45]。Zhangらも同様の観察を行った。完全長Sタンパク質を精製し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で分析したところ、S(D614)は前置S三量体、後置S2三量体、および解離したS1サブユニットを表す3つのピークに溶出したが、S(G614)は前置S三量体の90%を構成する1つの主要なピークにのみ溶出したことがわかった[49]。S(D614)とS(G614)の類似したSECプロファイルがGobeilらによって得られ、S(G614)の方がS1保持率が高いことが確認された[52]。さらに、Zhangらは、Sタンパク質三量体の低温電子顕微鏡構造の解釈において、減少したシェディングのメカニズムを説明している。彼らは、S(G614)三量体ではCTD2の∼20-residueセグメントが秩序化されているのに対し、S(D614)三量体では同じ領域が大きく乱れていると説明している[49]。著者らは、S(G614)のこの構造化されたループが、NTDとCTD1の間に挟まれることで三量体のパッキングを安定化させ、CTD2の疎水性表面を封鎖することで、S1の解離を阻害していると考えている[49]。

5. G614ウイルスはD614ウイルスと同様に中和に敏感である

D614G突然変異の一つの側面として、感染性の増加のメカニズムよりも広く研究されてきたのは、ワクチンや抗体への影響である。初期の議論では、S(D614)を標的としたワクチンはS(G614)を持つウイルスに対して限定的な防御を提供する可能性があり、感染した個体の抗体は交差防御を提供しないことが示唆されていた[64]。実際、同じSタンパク質バリアントを持つ2つの独立した分離株での再感染が報告されているが[65]、最近の症例報告では、D614ウイルスでの初感染に続いてG614ウイルスでの再感染が確認されている[66,67]。しかし、多くの研究では、体液性免疫が両変異型に対して防御的である可能性が示されている。YuanとLiは、Sタンパク質から12の直線的なB細胞エピトープと53の不連続なB細胞エピトープをin silicoで予測し、D614G変異が予測されたエピトープに無視できるほどの影響を与えることを発見した[68]。S(G614)およびS(D614)シュードウイルスの中和に関する実験データが豊富に報告されている。大多数の実験では、S(D614)とS(G614)の両方のPVが、一方または他方のSタンパク質バリアントに対して指示された抗体または患者抗血清によって同様の中和を示している[28,35,51,[69], [70], [71], [72], [73], [74], [75], [76], [77], [78]]一方で、いくつかのケースでは、S(G614)は中和に対してより大きな感受性を示した[51,57]。S(G614)変異体の同様の中和またはより大きな感受性は、生きたSARS-CoV-2でも再現されている[47,48]。いくつかの候補ワクチンがマウス、サル、フェレットモデルで評価され、S(D614)およびS(G614)に対して同等の中和活性を持つ抗体を誘発した[[79], [80], [81]]。これらの実験データで強調されているように、単一残基突然変異は、Sタンパク質のコンフォメーションを大きく変化させない限り、ウイルスの中和に対する感受性を変化させることはないであろう。

6. 議論

現在の文献によれば、SARS-CoV-2 Sタンパク質の D614G 変異がウイルスの感染性と伝染性を有意に高めることが明らかになっている。徹底的な機能的ウイルス学的研究によりこの変化の効果が確認され、疫学的データを精査すると、この遺伝子型の増殖は単に創始者効果だけでは説明できないことが明らかになった。D614変異体は、G614を保有する分離株に取って代わられる前に、いくつかの地域で十分に確立されており [32]、データ解析はG614の優勢が選択によるものであるという主張を支持している [82]。しかし、この突然変異が感染性を高める正確な分子機構については、まだ完全には解明されていない。例えば、S(G614)のACE2に対する親和性がS(D614)と同等かそれ以下であることを示すデータは、S(G614)がACE2との相互作用に有利なコンフォメーションを促進するという結論とは矛盾している。この問題について明確な結論を得るためには、人工的な三量体化モチーフを導入せずにスパイク三量体を生成することが技術的に困難である。また、スパイクトリマーを安定化させるために導入されたfurin-null変異は、自然なS1の脱落を妨げるため、データの解釈が複雑になる。一方、S1とS2の間の分子間相互作用の安定化は、S1の脱落を減少させ、より効率的なスパイクのウイルスへの取り込みをもたらし、アビジティ効果によるD614Gウイルスの感染性の向上を説明することができる。結局のところ、この分野では、現時点で利用可能な実験データ全体と一致する作業モデルには至っていない。しかし、このテーマに関する研究が急速に拡大し、膨大なデータが得られたことは、この未曾有のパンデミックに対応するための基礎的な分子ウイルス学の重要な役割を示すものである。D614G突然変異がその効果を発揮する分子機構の理解が不完全であることに加えて、この突然変異が健康に与える影響もまだ完全には明らかになっていない。例えば、Butowtらは、S(G614) SARS-CoV-2の同時出現と、臨床的に観察される無呼吸症が機能的に関連していると推測している[83]。上で検討した臨床および疫学的データは、D614G突然変異は感染性には有利であるが、他の突然変異が頻繁に併発するため、疾患の重症度に対するその影響は不確かであることを示唆している。

SARS-CoV-2は、SARS-CoV-1や他の既知のサルベコウイルスには見られないフーリン切断部位を獲得した。研究は、このフーリン切断部位の変異がウイルスの感染性を低下させるため、このフーリン切断部位の獲得がウイルスにとって有益である可能性があることを示してきた[4,14,21,58]が、他のコンテクストまたはフーリン切断部位の他の変異では、感染性が増加する[4,35,58,59]。フーリン切断部位を持たないウイルスが、生体内でより効率的に複製するかどうかは、現在のところ分かっていない。我々が知っているのは、SARS-CoV-2のリザーバーと推定される種から分離されたウイルスのいずれもフーリン切断部位を持っていないことと、フーリン切断部位の獲得は最近であり、おそらく人獣共通感染症の発症時期に近いものである可能性があるということである。したがって、フーリン切断部位の獲得はヒトへの感染または伝播にとって重要である可能性があり、その可能性はパンデミック中もフーリン切断部位が保持され続けていることからも裏付けられている。しかし、フーリン切断部位がSタンパク質の安定性を低下させたため、ウイルスはこの不安定性を補うためにD614G変異を獲得したのかもしれないいずれにしても、D614Gの優勢は、フーリン切断部位と同様に、ウイルスにとって有益であることを示している

現在のパンデミックの間、これまでのところ、Sタンパク質のD614Gには1つの突然変異しかなく、これはウイルスに明らかな適合性の優位性を与えている。パンデミックが長期化した場合に、さらに同様の変異が出現するかどうかは定かではないが、希望を持てる理由がある。

第一に、抗体反応からSタンパク質に大きな選択的圧力がかかっているようには見えないが、これはおそらくウイルスが中和抗体反応を起こすよりも早く新しい宿主に移動するためであろう。実際、出現した単一のSタンパク質変異、D614Gは、Sタンパク質の中に埋もれており、重要な抗体エピトープには大きな影響を与えない。

第二に、SARS-CoV-2は現在、世界的なパンデミックを維持する能力によって示されるように、優れた進化のニッチを占めている。ウイルスのアキレス腱であったSタンパク質不安定性の急性選択的圧力は、D614G突然変異によって解消された。Sタンパク質の不安定性によってもたらされるのと同様の選択的圧力は、これ以上はないかもしれない。