神経細胞におけるメタロチオネイン-3の機能。金属イオンはMT3の発現レベルを変化させるか?

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3型(有害金属) 有害金属

Function of Metallothionein-3 in Neuronal Cells: Do Metal Ions Alter Expression Levels of MT3?

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5485957/

要旨

メタロチオネイン-3(MT3)の機能に影響を与えると考えられる因子の研究を行い、MT3がヒトのメタロニューロ化学において果たす不透明な役割を明らかにした。マウス脳の歯状回から抽出した組織とヒト神経細胞培養物を用いて、Mt2 と Mt3 の遺伝子発現を調べた。

全ゲノム遺伝子発現解析の結果、Mt2とMt3を含む亜鉛ホメオスタシスに関連する遺伝子のmRNAレベルに有意な変動が認められた。その結果、Mt3 は、同定されたグループの中で最も発現に差があることが明らかになり、Mt3 の発現を異なる形で制御する因子が存在することが示唆された。

神経細胞におけるヒトメタロチオネインの発現を調べるために、鉛、亜鉛、コバルト、リチウムで処理したBE(2)CおよびSH-SY5Y細胞培養物において、MT3とMT2のmRNAレベルを比較した。その結果、両細胞培養物において、MT2はZn2+により高発現し、MT3は影響を受けず、他の金属はMT2とMT3のいずれにも影響を与えなかった。

キーワード

メタロチオネイン、MT3,メタロ神経化学、鉛神経毒性、遺伝子発現、マイクロアレイ、歯状回

1. はじめに

哺乳類メタロチオネイン-3アイソフォーム(MT3)は、神経化学における不可解な役割を持つ珍しいタンパク質である[1]。典型的な哺乳類のメタロチオネインの特徴を持ち、68個のアミノ酸で構成され、そのうち20個はシステインである。したがって、他のメタロチオネイン(MT)と同様に、亜鉛(Zn)や銅(Cu)などの必須金属イオンを結合し、カドミウム(Cd)や銀(Ag)などの有害金属イオンを隔離すると考えられている[2]。ほとんどの哺乳類のメタロチオネインは、金属応答性転写因子へのZn2+の結合によって開始されるメカニズムによって、高レベルの亜鉛によって誘導される[3]。Cd2+およびAg+のような毒性金属はメタロチオネインに結合した亜鉛を置換するため、それらの存在はまた、間接的にMTレベルの上昇を導く。

MT3は、その構造に通常の20個のシステインが存在するにもかかわらず、最初にメタロチオネインとしてではなく、神経細胞増殖の阻害剤として同定された [4,5]。神経細胞の増殖を阻害する能力の分子基盤は解明されていないが、その効果はMT3に特有の7-アミノ酸の酸性領域と関連しているとされている[6]。β-アクチンの重合は細胞骨格の成長に関与しており、MT3の神経細胞増殖抑制効果はβ-アクチンとの相互作用を介して起こるのではないかとの憶測を呼んでいる[8]。

MT3は正常なヒトの脳で特異的に発現しており、アルツハイマー病患者の脳では有意に低発現である [1,4,9]。中枢神経系における「正常な」生体無機化学の構成要素についてはほとんど知られていないが [10]、最近の研究では、脳における亜鉛イオンと銅イオンの必須の役割が指摘されており、両方のイオンが神経細胞のシグナル伝達に機能しうることが示唆されている [11]。したがって、MT3が脳内の必須金属イオン(亜鉛、銅)治療用金属イオン(リチウム)毒性金属イオン(鉛)の生体無機化学を調節する可能性があることは注目に値する。MT3は、生体分子に結合して高度に調節されているだけでなく、動的で緩く結合したプールに存在していることが脳内で発見されている銅の化学を媒介する特別な役割を果たしていると推測されている[11]。私たちは、鉛(Pb)への暴露が脳の発達に及ぼす影響にMT3が関与しているのではないかと推測している[12]。幼少期の鉛への曝露は、ある種の精神疾患のリスクの増加を含む、不可逆的で長期的な発達への影響をもたらすことがよく知られている[13,14]。塩化リチウムを投与するとマウスの脳内のMt3のレベルが低下するという報告に基づいて、我々は双極性気分障害に苦しむ人々のリチウム治療の薬理学的利益にMT3が関与している可能性を検討してきた[15]。

本論文では、MT3遺伝子の発現と間接的に機能に影響を与える可能性のある因子を探索する。MT3は歯状回(DG)に豊富に存在することが知られている[16]。ここで発表された、リッターメイトをマッチさせたマウスの歯状回における遺伝子発現の研究では、亜鉛の恒常性に関連する他の一連の遺伝子とともに、Mt3の発現レベルに有意な差があることが明らかになった。有意なことに、一方のマウスではMt2の発現が上昇していたのに対し、もう一方のマウスではMt3の発現が上昇しており、これら2つのメタロチオネインの制御機構が大きく異なっていることが示唆された。

また、ヒト神経細胞におけるメタロチオネインの発現レベルに影響を及ぼす可能性のある無機因子についても調べた。金属イオンがMT3レベルに及ぼす役割については、相反するデータが発表されており、複数の細胞株でMT3の発現を研究することの重要性が指摘されている[17,18,19]。我々は、MT2と比較して、MT3が同一の金属処理に対して異なる反応を示すことを示す。金属イオンがMT3レベルに及ぼす効果は、これらの金属イオンがMT2レベルに及ぼす効果よりもはるかに控えめである。この事実は、再び、神経組織におけるMT2対MT3の発現を異なる方法で制御する可能性のある制御機構を指し示している。

2. 結果

本研究では、マウス脳内のMT3/MT2と既知の亜鉛ホメオスタシス遺伝子発現との関係を調べ、神経細胞培養物中のMT3とMT2のレベルが金属イオン処理にどのように反応するかを比較することで、MT3の金属神経化学の理解を深めることに焦点を当てた。最終的には、この研究は、MT3が関与する金属介在プロセスに関する分子レベルの知識と、哺乳類の神経生物学におけるより全身的な役割を結びつけるための当研究室の継続的な取り組みの一環である。

2.1. マウス歯状回における亜鉛恒常性遺伝子の発現解析

成体マウスの脳サンプルから抽出した DG 組織を用いて作成した全ゲノム遺伝子発現データセットのデータマイニングを用いて、Zn ホメオスタシスに関連する遺伝子の発現プロファイルを評価した。データセットは、Agilent遺伝子発現アレイ上の60,000個のプローブで表されるマウスの遺伝子相補体をマイクロアレイ解析して生成したもので、バックグラウンド以上のハイブリダイゼーションシグナルから存在すると同定された21,000個の遺伝子から構成されている。

細胞性亜鉛イオンホメオスタシスの遺伝子オントロジー検索を行ったところ、39 個の遺伝子が見つかり、そのうち 25 個の遺伝子が DG で発現していることがわかった(表 1)。これらの遺伝子の中には、亜鉛イオン輸送に関連するメタロチオネインタンパク質をコードする遺伝子が3つあり、溶質輸送体タンパク質ファミリー30と39の主要な亜鉛輸送体が全て含まれていた。階層的クラスタリングを用いて、DG組織サンプル中のこれらの遺伝子の発現パターンの可能性を検索すると、2つのグループの動物の存在が明らかになった。この2つのグループは、ほぼ同じ大きさで、Zn結合トランスポーターのグループ特異的な共発現パターンによって識別することができる(図1)。

図1 Znトランスポーターの発現に関連する遺伝子発現プロファイルの階層的クラスタリング

Znトランスポーターをコードする遺伝子は行として示されており、個々にテストされた動物のサンプルは列として示されている。ヒートマップの発現変化は、その値に応じて色分けされたzスコアで表される:赤の四角は、発現レベルの正の変化(アップレギュレーション)に対応し、青の四角は、遺伝子発現の負の変化(ダウンレギュレーション)に対応し、白は変化の欠如を表している。遺伝子発現プロファイルを階層的にクラスタリングすると、図の上にそれぞれ緑の木と青の木で示されているように、2つの異なるグループの動物が存在することが明らかになった。


表1 Zn イオンホメオスタシスに関連する遺伝子

表1

亜鉛イオンの恒常性に関連する遺伝子。遺伝子オントロジー(GO)にZnイオンホメオスタシスに関連するものとしてリストされている39個の遺伝子のうち、25個がこの研究の海馬歯状回サンプルでバックグラウンドレベルを超えて発現しました(赤で表示)。

遺伝子 遺伝子/製品名 GOターム 用語の説明 レジストリ
Ap3b1 アダプター関連タンパク質複合体3、ベータ1サブユニット GO:0006829 カルシウムチャネルレギュレーター活性 MGI:MGI:4441257 | PMID:17349999
Ap3d1 アダプター関連タンパク質複合体3、デルタ1サブユニット GO:0061088 亜鉛イオンの隔離の規制 MGI:MGI:4834177 | GO_REF:0000096
Atp13a2 ATPaseタイプ13A2 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4834177 | GO_REF:0000096
Gtf2i 一般的な転写因子III GO:0051481 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4417868 | GO_REF:0000096
Mt1 メタロチオネイン-1 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:2177111 | PMID:11792622
Mt2 メタロチオネイン-2 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:2177111 | PMID:11792622
Mt3 メタロチオネイン-3 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:5315330 | PMID:21359432
Nrxn2 ニューレキシンII GO:0005246 カルシウムチャネルレギュレーター活性 MGI:MGI:3040168 | PMID:12827191
S100a6 ref | Mus musculus S100カルシウム結合タンパク質A6(カルサイクリン)(S100a6)、mRNA [ NM_011313 ] GO:0005509 カルシウムイオン結合 MGI:MGI:4834177 | GO_REF:0000096
S100b ref | Mus musculus S100タンパク質、ベータポリペプチド、神経(S100b)、mRNA [ NM_009115 ] GO:0005509 カルシウムイオン結合 MGI:MGI:4417868 | GO_REF:0000096
Slc30a1 溶質キャリアファミリー30(亜鉛トランスポーター)、メンバー1 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:3056220 | PMID:15452870
Slc30a3 溶質キャリアファミリー30(亜鉛トランスポーター)、メンバー3 GO:0032119 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4441264 | PMID:16741752
Slc30a4 溶質キャリアファミリー30(亜鉛トランスポーター)、メンバー4 GO:0061088 亜鉛イオンの隔離の規制 MGI:MGI:4459044 | GO_REF:0000033
Slc30a5 溶質キャリアファミリー30(亜鉛トランスポーター)、メンバー5 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4834177 | GO_REF:0000096
Slc30a6 溶質キャリアファミリー30(亜鉛トランスポーター)、メンバー6 GO:0061088 亜鉛イオンの隔離の規制 MGI:MGI:4459044 | GO_REF:0000033
Slc30a9 溶質キャリアファミリー30(亜鉛トランスポーター)、メンバー9 GO:0006829 カルシウムチャネルレギュレーター活性 MGI:MGI:1354194 | GO_REF:0000004
Slc39a1 溶質キャリアファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー1 GO:0006829 カルシウムチャネルレギュレーター活性 MGI:MGI:2683827 | PMID:14525987
Slc39a10 溶質キャリアファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー10 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:5586917 | PMID:25074913
Slc39a11 溶質キャリアファミリー39(金属イオントランスポーター)、メンバー11 GO:0006829 カルシウムチャネルレギュレーター活性 MGI:MGI:1354194 | GO_REF:0000004
Slc39a12 溶質キャリアファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー12 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4459044 | GO_REF:0000033
Slc39a13 溶質キャリアファミリー39(金属イオントランスポーター)、メンバー13 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4834177 | GO_REF:0000096
Slc39a14 溶質キャリアファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー14 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4834177 | GO_REF:0000096
Slc39a3 溶質キャリアファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー3 GO:0006829 カルシウムチャネルレギュレーター活性 MGI:MGI:2683827 | PMID:14525987
Slc39a6 溶質キャリアファミリー39(金属イオントランスポーター)、メンバー6 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4834177 | GO_REF:0000096
Slc39a7 溶質キャリアファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー7 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4459044 | GO_REF:0000033
Atp7b ATPase、Cu ++輸送、ベータポリペプチド GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:1100407 | PMID:9392450
Cp セルロプラスミン GO:0006879 細胞の鉄イオンホメオスタシス MGI:MGI:2152098 | GO_REF:0000002
ヘフ ヘファエスチン GO:0006879 細胞の鉄イオンホメオスタシス MGI:MGI:2152098 | GO_REF:0000002
ケル ケル血液型 GO:0006874 細胞のカルシウムイオン恒常性 MGI:MGI:5581641 | PMID:23122227
Pik3c2a ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ、C2ドメイン含有、アルファポリペプチド GO:0071583 亜鉛IIイオン輸送 MGI:MGI:5543317 | PMID:23823722
Slc30a10 溶質キャリアファミリー30、メンバー10 GO:0061088 亜鉛イオンの隔離の規制 MGI:MGI:4459044 | GO_REF:0000033
Slc30a2 溶質キャリアファミリー30(亜鉛トランスポーター)、メンバー2 GO:0061088 亜鉛イオンの隔離の規制 MGI:MGI:4459044 | GO_REF:0000033
Slc30a7 溶質キャリアファミリー30(亜鉛トランスポーター)、メンバー7 GO:0032119 細胞亜鉛イオンホメオスタシス PMID:17720550
Slc30a8 溶質キャリアファミリー30(亜鉛トランスポーター)、メンバー8 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4417868 | GO_REF:0000096
Slc39a2 溶質キャリアファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー2 GO:0006829 カルシウムチャネルレギュレーター活性 MGI:MGI:2683827 | PMID:14525987
Slc39a4 溶質キャリアファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー4 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:3028750 | PMID:14612438
Slc39a5 溶質キャリアファミリー39(金属イオントランスポーター)、メンバー5 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:3522410 | PMID:15358787
Slc39a8 溶質キャリアファミリー39(金属イオントランスポーター)、メンバー8 GO:0006882 細胞亜鉛イオンホメオスタシス MGI:MGI:4459044 | GO_REF:0000033
Slc39a9 溶質キャリアファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー9 GO:0006829 カルシウムチャネルレギュレーター活性 MGI:MGI:1354194 | GO_REF:0000004

 

その発現が2つの動物グループ間の分離を駆動する特定のZnトランスポーターを決定するために、我々は、これらのグループ間の遺伝子発現のt検定分析を行った。t検定分析は、Benjamini-Hochberg手順を使用して偽発見率(FDR)補正が続いた。その結果、メタロチオネインとトランスポーターをコードする11の遺伝子(表2にカラーで示す)が、動物サンプルの2つのグループへの分離に大きな影響を与えていることが明らかになった。これら 11 の遺伝子の発現プロファイルを基に再クラスタリングを行ったところ(図 2)グループ A とグループ B の 2 つのグループが明らかになった(グループ A は、Mt2 と S100b(Ca 結合蛋白質 B)をコードする遺伝子がアップレギュレーションされていることが特徴である)。識別遺伝子11個のうち、残りの9個はB群でアップレギュレーションされており、Mt3はA群と比較して最も発現量の差が大きいことがわかった。

図2 動物群AとBを区別する11の遺伝子に基づく遺伝子発現プロファイルのクラスタリング

ヒートマップにおける発現変化は、その値に応じて色分けされたzスコアで表される:赤の四角は発現レベルの正の変化(アップレギュレーション)に対応し、青の四角は遺伝子発現の負の変化(ダウンレギュレーション)に対応し、白は変化がないことを表する。


表2 識別された2つの動物群を区別するZnトランスポーター遺伝子

赤と青で示されている11の遺伝子は、図1で同定された2つの動物グループ間の主な違いを占めている。他の Zn トランスポーター遺伝子は、グループ間の発現レベルの統計的に有意な変化を示していない。11の異なる発現遺伝子のうち、2つの遺伝子(青で示されているMt2とS100b)は、グループBと比較して、動物グループAでアップレギュレーションされている。

遺伝子 P -Value 統計学的に重要な? 相対式値、グループA 相対式値、グループB log2R
Ap3d1 0.000 はい 10.234 10.015 0.219
Atp13a2 0.002 はい 12.355 12.143 0.212
Mt2 0.000 はい 15.108 15.370 −0.262
Mt3 0.000 はい 15.251 14.301 0.950
Nrxn2 0.002 はい 12.817 12.617 0.200
S100a6 0.000 はい 10.282 9.739 0.542
Slc30a1 0.000 はい 8.177 7.487 0.690
Slc39a7 0.023 はい 11.370 11.198 0.171
S100b 0.000 はい 11.140 11.634 −0.494
Slc30a3 0.000 はい 9.947 9.349 0.598
Slc39a3 0.000 はい 10.368 10.054 0.314
Slc30a9 0.162 番号 10.367 10.208 0.159
Gtf2i 1.000 番号 11.863 11.918 −0.055
Mt1 0.165 番号 7.607 7.404 0.203
Mt1 1.000 番号 15.846 15.801 0.046
Slc30a4 1.000 番号 8.711 8.744 −0.033
Slc30a5 1.000 番号 8.351 8.345 0.006
Slc30a6 0.880 番号 6.906 6.749 0.157
Slc30a9 0.536 番号 7.993 7.851 0.143
Slc39a1 1.000 番号 10.034 10.087 −0.053
Slc39a10 0.075 番号 9.312 9.489 −0.176
Slc39a11 1.000 番号 9.436 9.497 −0.061
Slc39a12 1.000 番号 8.267 8.215 0.053
Slc39a13 0.092 番号 7.053 7.399 −0.346
Slc39a14 1.000 番号 8.260 8.351 −0.092
Slc39a6 1.000 番号 10.298 10.241 0.057

 

Zn イオン輸送に関与する遺伝子以外にも、A 群と B 群を区別する遺伝子や分子機能を見つけるために、両群間の遺伝子発現をグローバル(ゲノムワイド)に比較し、A 群と B 群で発現が異なる遺伝子の機能的富化を解析した。その結果、両群ともに金属結合タンパク質をコードする遺伝子が多く過剰発現していることがわかったが、A群で過剰発現している遺伝子はB群で過剰発現している遺伝子とは異なることがわかった。また、A群では、シナプス機能やシグナル伝達経路に関連する遺伝子が有意に濃縮されていた。

B群でアップレギュレーションされた遺伝子群は、統計的に有意なアップレギュレーションが顕著であった。これらの遺伝子は、リボソーム機能、活性な転写・翻訳、その他代謝活性の高い細胞に特徴的なプロセスに関連する機能カテゴリーに富んでいる。驚くべきことに、このグループでは、アップレギュレーションされた遺伝子のいくつかの大きなサブセットが疾患に関連しており、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病に関連した機能経路に関与する遺伝子が含まれている。これらの異なる遺伝子の歯状回での発現を支配する共通の制御テーマは、2群のマウスの歯状回ではまだ見つかっていない。また、これらの違いは性差とは無関係であることも注目される。

2.2. 金属処理後のMT2およびMT3 mRNA発現の解析

様々な過剰金属処理に曝露した細胞における MT2/3 mRNA の相対的な発現を測定するために、RNA を抽出し、逆転写して cDNA ライブラリーを得た後、qPCR に基づいて遺伝子の相対的な発現レベルを決定した。異なるタイムポイントを探索したが(データは示されていない)本研究では曝露後 4 時間の結果を使用した。表3および表4は、非金属処理した対照に対するMT2およびMT3発現の相対的な変化を示し、対照遺伝子HSP90ABIに正規化したものである。qPCRデータに基づいて、BE(2)CおよびSHSY5Y細胞株の両方におけるMT2は、100μM Zn2+の存在下で高度にアップレギュレートされた。データはまた、100μM Zn2+がいずれの細胞株でもMT3レベルに影響を及ぼさなかったことを、等しく明確に示している。他の金属は、これらの細胞株におけるMT2またはMT3レベルのいずれにも有意な影響を及ぼさなかった(図S1に示すすべての実験からのデータ)。予備的研究は、Cu(II)がMT3発現に統計的に有意な効果を持たなかったことを示した。

表3 金属処理後の相対的なMT2 mRNAレベル

すべての結果は、非金属処理した対照細胞およびハウスキーピング遺伝子HSP90ABIに対して正規化したものである。結果は、BE(2)C細胞およびSH-SY5Y細胞について、それぞれ6回および5回の生物学的レプリケートの平均である。各生物学的レプリケートは、3つの技術的レプリケートの平均である。標準誤差は括弧内に示す。

Cell Line No Treatment Pb Zn Co Li
BE(2)C 1 1.66 (0.77) 24.58 (6.23) 1.45 (0.46) 1.16 (0.37)
SH-SY5Y 1 0.97 (0.04) 16.19 (2.13) 1.18 (0.14) 1.35 (0.27)

表4 金属処理後の相対的なMT3 mRNAレベル

すべての結果は、非金属処理した対照細胞およびハウスキーピング遺伝子HSP90ABIに対して正規化したものである。結果は、BE(2)C細胞およびSH-SY5Y細胞について、それぞれ6回および5回の生物学的レプリケートの平均である。各生物学的レプリケートは、3つの技術的レプリケートの平均である。標準誤差は括弧内に示す。

Cell Line No Treatment Pb Zn Co Li
BE(2)C 1 1.30 (0.34) 1.20 (0.44) 1.99 (0.58) 1.16 (0.16)
SH-SY5Y 1 0.66 (0.14) 0.76 (0.28) 1.17 (0.28) 1.23 (0.33)

3. 議論

メタロチオネインは小さなタンパク質であり、その分子の単純さは、その機能を確定的に決定するための努力に満ちた歴史とは裏腹である [20,21,22]。紛らわしい生化学的機能で知られるこのタンパク質ファミリーの一員であるMT3は、哺乳類の生物学においてさらに不透明な役割を果たしている。本研究では、MT3の発現を調節する因子を研究し、異なる金属イオンとの結合によってもたらされる構造変化の程度を特徴づけることによって、MT3の生物学的な洞察を提供しようとしている。

メタロチオネインは亜鉛シャペロンとして作用し、亜鉛イオンを標的部位に輸送し、必要に応じて亜鉛イオンの放出を促進すると考えられている[1]。この機能と一致するように、ほとんどのメタロチオネインは高レベルの亜鉛によってアップレギュレーションされる。MT1とMT2のプロモーター領域に金属応答エレメント(MRE)が存在することで、ほとんどのメタロチオネインが亜鉛によって誘導されるようになる [3]。MREは、ジンクフィンガー含有金属転写因子1(MTF1)との相互作用を介して活性化される [23]。MTF1は、重金属および酸化ストレスに関連する多くの遺伝子を調節する役割を担っている[23]。メタロチオネインはMTF1の典型的な遺伝子標的である。

メタロチオネインはまた、「重金属スポンジ」として機能し、有害金属イオンを結合し、潜在的に重金属を隔離すると考えられている。カドミウムや銀などの重金属は、メタロチオネインレベルを上昇させることが繰り返し示されている。しかし、その効果は間接的なものである。重金属はメタロチオネインから亜鉛を置換し、置換された亜鉛が金属転写因子に結合し、その亜鉛がMREに結合してメタロチオネインの転写を活性化するため、MTレベルに影響を与える[24]。興味深いことに、鉛が重金属であるという事実にもかかわらず、鉛がメタロチオネインのレベルに影響を与えるかどうかは明らかにされなかった[25,26,27]。我々は最近、鉛が約1×104の平衡定数でMt3から亜鉛を置換することができることを示し、したがって、生体内で亜鉛を置換することができ、上記のメカニズムによるMTのアップレギュレーションにつながるはずであることを示した[12]。それにもかかわらず、いくつかの発表された研究では、鉛処理後のMTレベルに変化がないことが示されている[17]が、他の研究では変化が見られる[28]。

メタロチオネインもまた、長い間、酸化ストレスを緩和する役割と関連してきた[22]。MTはジスルフィド結合を形成しながらZn2+と2つの電子を放出することができる。これは、免疫応答および炎症に関連している可能性がある[22,29]。MTF1はまた、セレンタンパク質HおよびWを含む細胞の酸化還元恒常性に関与する他の遺伝子の金属応答要素に結合する[30,31]。したがって、酸化ストレスとの戦いに関与するメタロチオネインおよび他のタンパク質が、酸化ストレスの条件下で同時に過剰発現することが推測される。

しかしながら、非常に重要なことに、MT3は他の哺乳類のメタロチオネインとは異なる形で調節されているようである[18,32]。MT3のプロモーター領域には、MT1およびMT2レベルを調節する金属応答エレメントに類似したいくつかの領域があるにもかかわらず、MT3は、他のMTが亜鉛に応答するのと同じ方法で、アストロサイトまたはニューロンのいずれにおいても亜鉛レベルに応答しないようである[1,5,17,19,32]。MTF1は、MT3プロモーター領域のMRE配列には結合しない[32]。

我々の細胞培養データとマイクロアレイデータの両方とも、脳ではMT3が他のメタロチオネインとは異なって制御されているという主張と一致している。我々の細胞培養データによると、2つの異なる神経細胞株において、亜鉛の添加はMT3にはほとんど影響を及ぼさないが、MT2を有意に過剰発現させることが示された。

マイクロアレイデータから、リッターメイトをマッチさせたマウスのグループ(A群)では、約半数の集団でMt2とS100bが統計的に有意に増加し、残りの半数の集団(B群)ではMt3と既知の亜鉛トランスポーター(S100a6,Src30a1,Src39a7,Src30a3,Src39a3,Ap3d1)Nrx2とAtp13a2が統計的に有意に増加していたことが明らかになった。Mt2がA群で高発現していたのに対し、Mt3がB群で高発現していたことは、これら2つの遺伝子が異なる制御を受けていることを示している。さらに、Mt3が他の多くの亜鉛トランスポーターとともに高発現していたことは、このタンパク質が脳内の亜鉛の恒常性に関与していることを示唆している。

特に注目すべきは、S100ファミリーのメンバーの発現パターンの違いである。S100bはMt2とともにアップレギュレーションされており、免疫応答に関与するカルシウムおよび亜鉛結合タンパク質を発現している。Mt3とともにアップレギュレートされたS100a6は、いくつかの神経変性疾患における亜鉛レベルの誤制御と関連しているカルシウムおよび亜鉛結合タンパク質を発現していた[33]。S100a6 は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびアルツハイマー病のマウスモデルで過剰発現しており、亜鉛に対する高い親和性を介して疾患の進行に寄与していると推測されている[34]。また、S100bは細胞増殖や神経細胞の変性にも関連しており、MT3もこのプロセスに関連している[35,36,37,38]。他の研究者は、S100bとS100A6がヒト皮質組織で異なる発現を示していることに注目し、同じ酵素ファミリーのメンバーであるにもかかわらず、それらが異なる神経化学的役割を果たしていると推測している[38]。S100bはニューライト伸長の形成を含む神経細胞の成長と関連している[38]が、S100a6は細胞骨格ダイナミクスと関連している(MT3と同様に[7,8])[39]。S100a6は酸化ストレス下でアップレギュレーションされることが知られている[39]。S100bは、メチル水銀曝露に対する栄養亜鉛の保護効果と関連しており[40]、双極性気分障害におけるMT2発現と関連している[41]。我々の研究室では、MT2/S100bとMT3/S100A6のこの差動発現に関連する分子機構をさらに探求するための追加研究が進行中である。

MT3発現に影響を及ぼすことが報告されている因子はいくつかある。これらには、リチウム(ダウンレギュレーション)年齢(アップレギュレーション)低酸素(アップレギュレーション)が含まれるが、いずれの場合も、この調節の分子機構は理解されていない。リチウムは、塩化リチウムを投与したマウスにおいて、MT3の発現を低下させることが示された[15]。しかし、我々の細胞培養の結果は、リチウムがMT3レベルに及ぼす影響を本質的に示さなかった。抗うつ薬のオイゲノールもまた、マウスの海馬においてMT3発現を誘導することが示されているが、MT1レベルには影響を及ぼさない[42]。これらの実験はいずれも、MT3が通常はメタロチオネインの機能に関連しない脳化学の側面で役割を果たしている可能性があり、また非MRE経路によるMT3の調節を示唆していることをさらに示唆している。

MT3レベルは加齢とともに増加する [36,43,44,45,46]。マウスの脳では、Mt3は生後12週間以降に高濃度で発見された[43]。ラットの脳では、中年(16ヶ月)を過ぎると非常に大きなMt3濃度の上昇が見られた[36]。著者らは、MT3がよりCu-thioneinの性質を持っていることから、そのアップレギュレーションは、老化した脳を銅酸化還元毒性から守るための銅キレートの役割が高まっていることを示唆しているのではないかと推測している。しかし、どのようなメカニズムで老化がMT3レベルの上昇につながるのかは不明である[36]。

MT3は低酸素にも反応する [45,46,47]。低酸素の1つの研究では、MT3は低酸素に対して最も感受性の高い遺伝子であり、10分および30分の処理後にそれぞれ3倍および7倍の発現レベルの増加を示した[45]。別の研究では、低酸素状態に曝露すると60分後にMT3レベルが600倍以上に増加した[46]。MT3遺伝子発現は低酸素模倣薬(CoCl2,デスフェリオキサミン、ジメチルオキサリルグリシン)によっても実質的に誘導されることが報告されており、これはHIF1を介して転写制御されていることを示している[46]。低酸素は亜鉛のホメオスタシスの不均衡に関連していることが示唆されている[47]。また、他のメタロチオネインは低酸素に反応することが示されているが、他のMTの場合、MREを介した活性化が関与していることが示唆されている[48]。ここでも、我々の細胞培養実験では、低酸素ミミックCo2+は、MT2またはMT3の発現レベルのいずれにも本質的に影響を示さなかった。

MT3レベルに影響を与える因子を研究することは困難であり、我々の研究はこのことをも示している。脳で測定されたレベルに匹敵するレベルまでMT3を発現する確立された細胞株はほとんどない[31]。この研究では、我々は2つの異なる神経細胞株を選択したが、いずれもMT3レベルが測定可能ではあるが極端に高いわけではないことが知られており、遺伝子およびタンパク質発現の増加(または減少)につながる可能性のある治療法を研究することが可能であった。それでも、細胞培養の研究は、動物モデルで見られる複雑さのすべてを捉えているようには見えない。

MT3がMT1とMT2に非常に多くの点で似ていることを考えると、どのようにしてその顕著に異なる神経化学的な説明ができるのだろうか?答えの一部は、おそらくMT3と他のMTの間の小さな構造的差異にかかっている[49]。MT3のユニークなN末端配列は、神経系におけるMT3の成長抑制活性に必要である[50]。また、近位尿細管細胞のCd2+誘導死にも関与することが示されている[50]。これらのアミノ酸は、アクチンへの亜鉛特異的なMT3の結合にも関与していることが示されている[7]。MT3のユニークな構造によって調節されるタンパク質-タンパク質相互作用は、MT3の神経化学的機能の多くにとって重要であるかもしれない[9,49]。メタロチオネインの3次元構造は、金属結合によって決定される。チオネインは、金属イオンの非存在下では構造化されておらず、7つの2価の金属イオンが結合すると2価のタンパク質に折り畳まれる[51,52]。超金属化は、タンパク質が単一の、より球状の構造を形成するように再配列する原因となることが示唆されている[53]。溶液中のアポ-MT2とアポ-MT3は、ヘリカル含量が低く実質的に同一の構造を有しており[54]、アポ-メタロチオネインはほとんど、あるいは全く二次構造を示さないという共通の見解を支持している[55]。しかしながら、金属の存在下では、メタロチオネインは様々な構造に折り畳まれる。メタロチオネインは、ランダムなコイルのセクションで区切られた四面体の配位したM3S9およびM4S11結合クラスターでZn2+およびCd2+のような2価の金属を結合している。これらの構造は、240 nmに正のピークを示す円二色性スペクトルによって特徴づけられる[56]。

我々や他の研究者は、鉛暴露の神経毒性効果のいくつかは、鉛と亜鉛との結合時のメタロチオネイン構造の違いによって媒介されているのではないかと推測している[12,57,58]。亜鉛は4つの配位数を好むが、これはチオールサイトとの四面体配位によって証明されている[56]。Zn2+の配位化学とは対照的に、Pb2+の配位化学ははるかに複雑で変化に富んでいる。最近の証拠は、4配位のPb(II)錯体がほとんどないことを示している。おそらく、鉛の(潜在的に)立体化学的に活性な一対が、その幾何学的嗜好を決定する役割を果たしているのではないかと考えられる。Heらは、3つの硫黄および電子供与性酸素(Pb-S3O)とMT2に結合した場合、鉛は三角錐配位を形成すると推測している[57]。MT2における8番目の金属結合部位の存在を含む、MT3と他のメタロチオネインとの間の金属結合選好性の既知の違いは、金属を完全に含んだMT3の全体的な構造に影響を与える可能性が高い [54,61,62]。これらの構造の違いが、MT3がパートナータンパク質と相互作用する方法の機能的な違いにつながるかどうかを決定するための研究が進行中である[9]。

その答えの一部は、おそらくMT3の差動発現にもあると思われる。今回の研究では、MT3の差動発現は確認されたが、MT3が制御される分子機構が何であるかは明らかにされていない。我々の研究室では、MT3の制御経路に関連する仮説を検証するための追加研究も進行中である。

4. 材料と方法

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