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www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7310912/
要旨
コロナウイルス関連の感染症は、世界中で絶えず出現し、公衆衛生を脅かしている21世紀最大の課題のようである。2019年12月末までに中国で呼吸器感染症の原因として検出されたコロナウイルス病19（COVID-19）は、2020年1月に世界保健機関（WHO）が国際的な懸念の公衆衛生の緊急事態を宣言し、その結果、2020年3月にパンデミックが発生したことを衝動した。
過去6ヶ月間にCOVID-19パンデミックは、南極を除くすべての大陸を包み込みました。世界中の科学者たちは、より低い罹患率と死亡率でパンデミックの最終的なリスクと規模を小さくする方法を見つけている。
このような状況の中で、シーケンシング、クリスプル、人工知能などの技術は、従来の方法とは対照的に、感染症の診断と管理において重要な役割を果たしている。にもかかわらず、感染症を漸近状態で認識する迅速かつ早期の診断ツールやシステムが求められている。
ここでは、最近のCoV感染症の発生状況と技術の貢献について、今後の感染症の検出管理に重点を置いて概説する。
キーワード 感染症、コロナウイルス、COVID-19、シークエンシング、CRISPR、人工知能
序論
スペイン風邪からCOVID-19に至るまで、感染症は頻繁に発生しており、テロリズムよりも世界的な健康への脅威となっており、個人の健康、経済、社会福祉に多大な損失をもたらしている[1]。細菌、ウイルス、真菌、寄生虫からなるいくつかの病原体が感染症の主な原因となっている[2]。
これらの病原体は、その微細な構造と循環の早さから、同定された病原体や未同定の病原体が、いつでも迅速に発生・拡散し、あらゆる集団に被害を与える可能性がある[3]。安全対策や監視体制が整っているにもかかわらず、世界的に致死的な影響を及ぼす感染症が発生している（図1）。このような感染症は、感染症の疑いのある人やその家族、医療従事者の心身の健康を脅かしていることが明らかになっている[4]。
過去20年の間に、重症急性呼吸器症候群（SARS-2002：感染者数8000人、死亡者774人）、中東呼吸器症候群（MERS-2012：死者858人、感染者2494人）、そして現在進行中のCOVID-19パンデミックを含むコロナウイルス（CoV）関連の感染症は、人獣共通感染症のリザーバーから、地球上の住民に深刻な健康被害をもたらすために繰り返し進化していた[5]。
数ヶ月前の2019年12月下旬に、原因不明の肺炎は、後にCOVID-19と命名された中国武漢で報告されたが、これは、呼吸器感染症の原因物質としてCoVの新しい株、すなわちSARS CoV-2の浸潤のためである。世界中での活発なパンデミックにより、世界保健機関（WHO）は2020年1月に国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態を宣言し、その結果、2020年3月にパンデミックが発生することになった[6]。
2020年5月9日現在、187以上の国と地域で397万人以上の感染者と27万6,000人以上の死亡者が報告されている。COVID-19の世界的な広がりは、可能な限り早期にこのパンデミックを制御することが必要であることを強調している。
そうでなければ、世界大戦よりも100万人もの死者を出した20世紀最大の感染症の一つであるスペイン風邪の数字を超える可能性がある[3]。原因菌を迅速に検出する技術はあるが，早期発見に役立つ診断ツールが必要とされている．ここでは，これらの感染症の検出に向けた今後の管理に重点を置いて，CoVの発生状況と技術の貢献について概説する．
1918年から 2019年の間に地球儀周辺で発生した感染症の歴史
コロナウイルスの分類・起源・疫学・遺伝学
コロナウイルス(CoV)は、世界の創造以来、自然界を循環しているが、動物や人間にも存在するが、その起源は不明である。科学的な努力によりその階層が明らかにされ、ニドウイルス目、コロナウイルス科、オルソコロナウイルス亜科、サルベコウイルス亜属、βコロナウイルス属・属に分類されている[7]。顕微鏡で観察すると、これらのウイルスはテニスボールのような形をしており、外皮や膜にチクチクとした突起があり、これが王冠のような形をしており、宿主（動物やヒト）系に付着して侵入するのを助けている[4]。
宿主細胞に侵入した後、RNAゲノムを放出し、宿主細胞の機械を利用して大量の子孫を産生し、宿主の臓器・細胞を感染させて病気にさせるだけでなく、追放された後に他の宿主に感染させて感染症を引き起こすことで知られている[8]（図2）。
CoV感染症は、呼吸器、気管支炎、肺炎、腎障害、消化器、神経疾患など、動物とヒトの両方でパンデミックしている。ヒトにおけるCoV感染症の有病率は、1965年に軽度の感冒（B814）で顕著になった。
その後、2019年までに、世界的にヒト感染症の原因となるα・βコロナウイルス属に属する7株のCoVが新たに同定されつつある（図3）。7株のうち、229E、OC43、NL63、HKU1を含む4株は、軽度の風邪/感染症でヒト集団内に維持・循環している。
しかし、SARS、MERS、COVID-19を含む3株は、一次人獣共通感染源から感染した中間キャリア/宿主を経由して、感染可能なヒト集団内で循環している[4, 9]。
図2 宿主細胞におけるCoVのライフサイクル。
CoVの感染は、細胞特異的な酵素活性化により細胞膜に付着したスパイク蛋白質を介して宿主細胞に侵入することで始まる(1)。付着後、スパイク蛋白質を介してCoVは宿主細胞の細胞質に侵入し、ゲノムRNA（ポジティブセンスRNA）を放出してmRNA（メッセンジャーRNA）の複製と転写を行う（2）。ウイルスゲノム（レプリカーゼ遺伝子）は、その後、ポリタンパク質pp1aと1abに翻訳され、これらは後に切断されて複製のための小さな産物に変換される(3)。次の段階では、ウイルスRNAが複製され、不連続転写によってゲノムポジティブセンスRNAの合成のための負鎖RNA（サブゲノムRNA）が生成される（4-5）。ゲノムRNAとNタンパク質はヌクレオカプシドに集合し、小胞体（ER）の細胞間膜、ゴルジ体中間コンパートメントで出芽する（6-7-8）。ライフサイクルが完了すると、ウイルスは細胞外に排出されて感染する準備ができている(9)。
図3 1960年から 2019年まで遡ったヒトコロナウイルス感染症の時系列図。
宿主の脆弱性に基づいて、CoVの疫学的調査は常に疑問視されてきた。例えば、SARS-CoVパンデミックのアウトブレイクは、中国広東省の動物市場から採取されたパームシベットと関連していた。しかし、追跡調査の結果、野生のカブトコウモリ（広東省の市場やレストランで販売・提供されている）がSARS-CoVパンデミックの発祥地であることが明らかになった[10]。
同様に、ドロメダリーラクダもMERS-CoV発生源の可能性があると考えられていたが、コウモリ由来のHKU4-CoVに関する研究では、両CoV株に共通する宿主侵入のポイントであるCD26受容体を仮定して、MERS-CoVがコウモリからラクダへと循環する可能性があると考えられていた[11]。
同様に，最近のCOVID-2019では，武漢市の水産物市場からの感染が報告されており，野生動物が病気の予後に関与していると推測されている．COVID-19の原因となったSARS-CoV-2は、SARS-CoVのパンデミックに関与したコウモリ株に属することが明らかになっており、未知の動物がコウモリとヒトの間の越境を促進する要因となっていることが示唆されている[6]。
さらに、ミンクやパンゴリンも中間宿主として発生に関与している。このような宿主の多様性と感受性に関する証拠から、CoVは全ゲノムの約25%の頻度で遺伝子を改変する高い突然変異・組換え能力を持ち、種の交雑（新しい宿主）、病原体の発生、遺伝的多様性を促進することが確認されている[12]。
CoV の遺伝的多様性や組換え能力は、ゲノムが大きいために頻繁に発生する。我々が知っているように、すべてのCoVのゲノムは26〜32キロベ ースの大きさであり、5〜3′末端を持つ一本鎖の非分割ポジティブセンスRNAを中心に、非構造遺伝子（レプリカーゼ遺伝子）と構造遺伝子（スパイク、メンブレン、エンベロープ、ヌクレオカプシド）を含む7〜9個の遺伝子が存在してい る。
非構造遺伝子・タンパク質のうち、キモトリプシン様プロテアーゼ、パパイン様プロテアーゼ、ヘリカーゼ、RNA依存性RNAポリメラーゼを含む4つのタンパク質は、ウイルスゲノムの複製・転写に不可欠である。しかし、2つのサブユニットS1とS2を持つスパイクタンパク質のような構造タンパク質は、ウイルスと宿主の細胞膜の結合と融合を助け、結果としてCoVゲノムが宿主細胞に放出されて感染することになる[5, 9]。
研究の結果、SARSとCOVID-19スパイクタンパク質残基の変異が、主にヒトの肺（肺胞上皮細胞）や小腸の腸球に存在するアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）を介して発病の引き金となる可能性が高いことが明らかになった。
SARS-CoV-2は受容体結合ドメインACE2を介して感染することが明らかになっており、SARSの病原体としても同定されている[6, 13]。また、中国各地のCOVID患者のサンプルでは、変異したSARS-CoV-2の配列に違いが見られ、病原性とパンデミックを精査するためには、SARS-CoV-2を綿密にモニターする必要があることを示唆している。
CoV感染 臨床観察と治療
CoV感染症は無症状であることが多く、ほとんどの患者は咳や疲労、頭痛を伴う軽度のインフルエンザ症状を呈する。無症状の潜伏期間は0～14日、時には21日と長いこともあり、国境を越えてCoVID-19感染を煽り、直接または間接的な接触を介して生まれたばかりの人から高齢者まで、ほとんどの年齢層の人々を包み込む原因となっている[14]。
直接接触（血液、唾液、精液、鼻・体液、動物の肉や製品）、または直接接触（感染した生物の咬傷、汚染された食品、水、寝具、布など）は、CoV感染症の発生にも同様に有害である。SARSやMERSと比較して、COVID-19は、SARS-CoV-2が上気道で複製し、膨大な数の病原性子孫を産生し、くしゃみや咳などの呼吸器伝播によって人から人へと放出・輸送されるため、感染が急速に拡大していると考えられている。
これに加えて、咳やくしゃみの際には、粘液滴が空気中に何時間も浮遊し、空気の流れに乗って移動し、空気感染を介して通行人に感染したり、感染した液滴が物体に付着することで、SARS-CoV-2は汚染された表面との接触を介して感染し、接触、エアロゾル、糞便による経口感染経路を提供することができる[15, 16]。
以前の研究では、COVID-19は女性よりも男性の患者に感染する可能性が高いことが示されていたが、最近のICUやICU以外の患者を対象とした研究では、湖南省の湿った動物市場で働くため、男性の方が女性よりも被害者が多い可能性があるという理由で、これを否定している[17, 18]。
同様に、COVID-19に感染した9人の妊婦から得られた臨床データによると、新生児に重度の肺炎を発症した妊婦はおらず、胎児への感染も子宮内垂直感染によるものと考えられている[19]。しかし、母親から生まれた10名の新生児を対象とした別の研究では、母子感染による新生児感染が認められており、COVID-19は年齢、性別、健康状態による感染の差別がないことが示唆された[20]。
COVID-19患者の臨床観察によると，無症状の場合は，発熱，倦怠感，乾いた咳，鼻閉，鼻水，咽頭痛，腹部苦悶，吐き気，嘔吐，腹痛，下痢などである．重症化すると、これらの症状は急速に重症化し、低血圧、多臓器不全、ショック状態、死亡に至る[19、21]。
これに加えて，COVID-19患者では，以前にSARSやMERSで診断されたように，細胞性免疫不全，凝固促進，心筋症性肝腎障害が観察された[20]．臨床観察に関する研究がいくつか行われているが、性別、年齢、健康状態などの最終的な危険因子を評価することは困難であるため、発症と治療には継続的な自然経過の観察が必要である。
COVID-19の治療は医療現場での大きな課題である。なぜならば、発病に関するデータが不十分であるため、有効性が証明された抗ウイルス療法がまだ利用できないからである。適切な薬物療法がないため、ワクチン、モノクローナル抗体、ペプチド、インターフェロンおよびオリゴヌクレオチドベースの治療法を含むいくつかの選択肢が、患者を治療するために使用されてきた[18]。
伝染病の初期には、ロピナビル、リトナビル、オセルタミビル、ガンシクロビルなどの抗ウイルス剤とコルチコステロイドが使用されていたが、WHOの暫定ガイドラインによると、肺損傷やショックのためにコルチコステロイド治療は中止されている[22]。
また、WHOのガイドラインではワクチンの準備に1年以上かかるため、モキシフロキサシン、セフトリアキソン、アジスロマイシン、グルココルチコイドなどの抗菌薬が使用されており、致命的なCOVID-19の影響を最小限に抑えるための支持療法やパーソナルケアの選択肢が実践されている。
技術によるCOVの検出
飛躍的な成長と技術の進歩により、ゲノム、微生物形質の類似性、疾患の慢性化に及ぼす宿主やウイルス因子の影響などを含めた感染症の同定方法が迅速に提供されるようになった [23]。
世界的には，COVID-19患者の鼻腔，咽頭スワブなどからSARS-CoV-2の核酸（RNA）を検出するRT-PCR（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）技術が標準的な診断ツールとして使用されている[24]。
さらに、人工知能ツールを用いたコンピュータ断層撮影（CT）スキャンによるCOVID-19診断は、迅速かつ正確な方法で、市中後天性肺炎、他の肺疾患、COVID-19に関連する肺合併症を鑑別するのに役立つ[25]。さらなる検証は、シーケンシング技術によって行われる可能性がある。
シーケンシング技術
最近のCOVID-19の発生では、分子診断ツールとしてのDNAシーケンス技術は、変異遺伝子や薬剤耐性遺伝子を同定することにより、感染症の早期診断、投薬、管理に顕著なパラダイムを示している。
MinION, (nanopore sequencing)は、サンプルから核酸を抽出し、増幅とバイオインフォマティクス解析を行うことで、1時間以内にSARS-CoV-2の原因となる配列を検出する携帯型DNAシークエンシング装置の一つである[15]。このようなシークエンシングによる分子設計図の詳細は、他の技術がこのような感染症の診断、予防、治療のための戦略を構築するための基盤となった。
CRISPR技術
原核生物の自然免疫系から採用されたクラスター化規則的に配列された短い回文リピート（Crispr）関連タンパク質（Cas）システムは、伝染性および非伝染性感染症に対する強力なツールである。感染症に対抗するために、宿主免疫系は、適応、発現、干渉の3つの段階を経て機能している[26]。
最初の段階では、Casタンパク質は、細菌が再びそれらを攻撃するときに、細菌がウイルスを思い出すことができるように、細菌のゲノムまたはクリスプル配列にスペーサーとして堆積した短い断片に侵略者ファージまたはウイルスの遺伝物質をカットする。発現段階では、スペーサーは、インベーダースペーサー配列と相補的なtracrRNAを含む小さなcrRNAに転写され、一緒にハイブリダイズして、Casタンパク質のリクルートのためのシングルガイドRNA（sgRNA）を形成する。
最後のステップでは、sgRNA と Cas タンパク質が融合して複合体を形成し、sgRNA は配列の類似性から標的を特定し、Cas タンパク質は特定のポイントで標的配列をスキャンして切断する [27]。カスタマイズ可能な RNA と様々な Cas タンパク質を用いた Crispr 技術は、あらゆる感染症に関与する関心のある遺伝子を編集、改変し、診断することができる [28]。
遺伝子編集技術としての Crispr は、感染症の分子解析のために病原体や宿主細胞の遺伝子改変を容易にしてきた。一方で、感染症の発現を活性化する宿主や病原体のタンパク質のスクリーニングや、ワクチンや抗菌薬の開発も、クリスプル技術によって可能となっている[29]。
その発見以来、sgRNA や Cas 酵素などの不可欠なツールを用いて、病気の診断、予防、治療に最先端のルートを提供していた。現在、Cas13 酵素を用いた特異的な高感度酵素レポーターアンロック（SHERLOCK）は、検体からの COVID-19 ウイルスシグネチャの検出、モニタリング、ジェノタイピングに使用されている[30]。
逆に、DNAエンドヌクレアーゼを標的としたCRISPRトランスレポーター（DETECTR）もまた、sgRNAとCas12の助けを借りてCOVID-19患者の鼻咽頭または咽頭スワブから標的RNA配列を感知するために使用されている。注目すべきは、アッセイを実行するためのポータブルマイクロ流体ベースのカートリッジと試薬の将来の開発は、臨床診断検査室の外でポイントオブケアテストを可能にする可能性がある[31]。
CoVの発生と将来の展望
CoVID-19の発生後、感染の危険因子、感染経路、感染の地理的広がりを理解するために、いくつかの情報源が疫学的、臨床的な証拠を継続的に共有し、記録している。これに加えて、このようなデータは、政策立案者や国際保健機関にとって、現在進行中の感染症や新たな感染症のサーベイランスシステムを改善するために不可欠なものとなる可能性がある。
世界中の研究者が、このようなアウトブレイクの最終的な規模を小さくし、地域や国際的なレベルで罹患率や死亡率を下げるための方法を見つけている[32]。世界的な感染症の発生を抑制するためには、迅速かつ早期の診断ツールやシステムが求められている。
COVID-19パンデミックで報告されたように，血液や綿棒などの体液を用いた診断法やモニタリング技術の改善は，通常，他の感染症患者や医療従事者の感染リスクを高める可能性がある。そのため，特に無症状の場合には早期診断に役立つ非侵襲的な診断ツールが必要である。
症状のない潜伏期間は、病気の拡大という点で致命的であることが証明されており、不明瞭な状態で迅速に機能する診断ツールが不足していることを示している。間違いなく、病気の診断のためにいくつかの画期的な技術が発売されているが、まだやるべきことはたくさんある。
疾患診断、特に無症状の場合に役立つとされる技術の一つに呼吸分析がある。過去20年の間に、研究者は人工知能（AI）技術を用いた呼気分析技術に取り組み、癌、呼吸器疾患、消化器疾患、感染症の診断に役立てている[33, 34]。呼気は、代謝反応の際に体内で生成される揮発性有機化合物（VOC）を含んでおり、健康な人と不健康な人を区別する上で非常に重要である。
酸化ストレス、炎症、喫煙、汚染、微生物の侵入などにより生化学的経路が変化し、その結果、組成や濃度が変化する揮発性有機化合物が生成されることがある。SchnabelらとNakhlehらは、癌、肺疾患、パーキンソン、人工呼吸器関連肺炎、腎臓疾患などの様々な疾患を患っている患者の特異的なVOCシグネチャーを明らかにした[35, 36]。
これらのデータは、発声器には疾患特異的なパターンやバイオマーカー（ストレスや微生物によって産生され、病原体のシグネチャーを表す）が含まれていることを示唆しており、感染症の診断のために再検査が可能であることを示している[37]。
したがって、疾患特異的な発声パターンに基づいて、ウイルス感染症の患者は発声プロファイルの変化を持ち、体内に感染症が発生した際に検出可能であるという仮説が立てられる。このような発声パターンをアルゴリズムを用いて認識することで、感染症の早期診断・制御に役立つと考えられる。
また、呼吸解析技術に加えて、人工知能技術を用いた音声からの疾患検出も注目されている。十分な根拠のある研究により、音声信号（特定の母音、単語、数字など）には発声バイオマーカーが含まれていることが示唆されており、病理医の疾患診断に大きな助けとなる可能性があると考えられている。
いくつかの機械学習アルゴリズムは、パーキンソン、うつ病、心臓病、その他の疾患を含む疾患予測において優れた精度を示している[38-40]。これらの知見を踏まえて、ウイルス感染症が疾患分析のための疾患特異的な声のバイオマーカーを含んでいるかどうかが仮説として考えられる。
呼吸と音声の両方の分析技術は、非侵襲的な装置を用いた感染症の早期診断に有効であると考えられる。声や声に基づく非侵襲的な診断ツールは、感染症の制御において大きな可能性を秘めていると考えられる。しかし、ヒトと病原体を識別する微生物の声を識別するための課題はまだ見つかっていない[37]。
一方で、新興のウイルス性感染症の70%は家畜や家禽に由来するものであり、これはヒトへの人獣共通感染症の発生頻度が低いという世界的な公衆衛生上のリスクをもたらしている[41]。
最近のCoVID-19パンデミックにより、中国ではSARSパンデミック時に採用された以前の戦略に従って、野生動物の取引を禁止している[42]。野生動物に法律を課すのではなく、動物に蔓延している病原体を迅速かつ効率的に早期に検出するためのツールが必要である。
テクノロジーの時代には、化学センサー、マイクロエレクトロニクス設計、人工知能が、動物の病気の予防、診断、管理に貢献している。ウェアラブル技術やバイオセンサーなどの技術の進歩により、家畜や鳥類の健康状態を管理することが可能になってきている[43-45]。
このような精密畜産成形技術に加えて、リアルタイムで健康状態の連続的な画像を提供し、動物と消費者の両方の安全に利益をもたらす迅速な調停を可能にすることで、動物の健康状態の管理と監視に役立つ可能性がある[46, 47]。
おわりに
人獣共通感染症の蔓延には、疾病監視のための統合的な戦術が必要である。将来的には、昆虫、蚊、ビット、ハエなどのCoV宿主の多様性が、無数に発生し、検出と排除の源が限られているため、健康と経済に深刻な影響を及ぼすことが想定され、新興感染症の分類、同定、治療のための精密診断のアプローチが切実に必要とされている。
感染症の発生は、診断と治療の面で常に困難であるため、声や呼吸の分析（特に漸近期に焦点を当てた）のような診断戦略は、病気の発生率と予後を開発するのに役立つかもしれない。このことは、患者の声や呼吸がウイルス性疾患の早期発見に重要な役割を果たしているのではないかという仮説を立てることができる。
バイオマーカーに成功すれば、非臨床環境での個別化されたスクリーニングツールとして、最終的なパンデミックのリスクを低減するための代替的な非侵襲的なポータブル機器が開発される可能性がある。呼吸や音声信号に基づいた診断アプリやデバイスは、感染症のタイムリーな診断のための実行可能なソリューションとなり、病気のリスクの強度と広がりを軽減する可能性がある。