健康増進剤の排除層サイズへの影響 EZウォーター
Effect of Health-Promoting Agents on Exclusion-Zone Size

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Effect of Health-Promoting Agents on Exclusion-Zone Size

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6122250/

2018年9月3日オンライン公開

キーワード EZ Water、イージーウォーター、EZ水、EZWater

概要

細胞内を含む親水性表面が水の構造変化を起こすことは、現在では十分に確認されている。この界面水は秩序化され、バルクとは異なる特徴を獲得する。その特徴の一つは、親水性表面に隣接する広い領域からコロイドや分子の溶質を排除することであり、そのため「排除層」(EZ水)というラベルが付けられている。

秩序あるEZ水がバルクに移行することは、多くの細胞生理学的機能、ひいては細胞の健康の重要な引き金となる。

我々は、一般に健康の回復や増進に役立つとされている半ダースの薬剤を生理学的に投与し、EZを形成する程度についてテストした。その結果、生体機能を向上させることが知られている薬剤はすべてEZを拡大させることが分かった。一方、除草剤のグリホサートは、EZの大きさを著しく減少させた。

健康増進効果のある薬剤は、幅広い濃度でEZの拡大効果が認められたが、過剰な投与は最終的にEZのサイズを縮小させた。このことから、健康増進効果のある薬剤の多くはEZの拡大がそのメカニズムであり、一方、健康阻害効果のある薬剤はEZの水量を減少させることによって作用しているのではないかと考えられる。

キーワード:排除帯水、親水性表面、用量依存性、健康増進剤、栄養補助食品、用量反応

はじめに

細胞内には秩序だった界面水が広く存在することが、先行研究により明らかになっている1,2。その後、細胞内を含む親水性表面に隣接するこの界面水の性質について、詳細な報告がなされている3,4。界面水は、「排除層(EZ)」あるいは「第4相(fourth phase)」と呼ばれている5。

細胞機能における水の中心的な役割は、近代生化学の父と呼ばれるSzent-Gyorgyiの時代から知られていた。5 細胞機能における水の中心的な役割は、現代生化学の父であるセント-ジャイ子の時代から知られていた。セント-ジャイ子の有名な言葉に、「生命は固体の曲に合わせて踊る水である」というものがある。この格言は、秩序ある水(現在では「EZ水」と呼ばれている)からバルク水への移行が多くの生理作用の重要な引き金となり、その水なしには細胞が適切に機能しないことを示す証拠によって、さらに実質化された2。

細胞機能におけるEZ水の重要な役割から、EZ水が欠乏すると細胞機能が損なわれ、その結果、健康が損なわれるという仮説が生まれた。逆に、EZ水が不足した場合、EZ水を再生させれば、健康状態は正常に戻るはずである。

そこで、一般に健康増進や健康回復に役立つとされている物質を用いて、この仮説を検証してみた。トゥルシー(ホーリーバジル)、Culturelle(クロムウェル、CT)キッズプロバイオティクス、ターメリック、ココナッツウォーターなどの栄養補助食品と、アスピリンやタイレノールなどの一般的に使用されている鎮痛剤について、その生理量を測定してEZ水を生成したり減少させたりする能力をテストしたのである。また、グリホサートを主成分とし、健康に悪影響を及ぼすことで知られる除草剤ラウンドアップについても、その効果が相反するものであるかどうかを検証した。

EZ水の量を調べるには、高分子材料のナフィオンを用いて、微小球を排除することでEZの大きさを決めるという、一般的になっている調製法を用った4。それぞれの薬剤の濃度を変化させることで、薬剤がEZのサイズをどの程度増減させるかを評価することができた。

材料と方法

排除帯核形成面

ナフィオンチューブは PermaPure LLC (Lakewood, NJ) から入手した.TT-020 (内径 0.36 mm) と TT-0030 Nafion (内径 0.53 mm) の 2 種類のモデルを使用した。チューブの取り扱いには滅菌手袋を着用し、注意を払った。ナフィオンチューブは、市販の器具 “The Chopper” (NorthWest Short Line)を用いて、滑らかなエッジを持つ等長ピースに切断した(図1 AおよびB)。

図1.チョッパー

ナフィオンチューブをチョッパーで切断し、2~3mmの等長平滑片とした(A)。(B) 切断したナフィオンをピンセットで操作し、シャーレに入れたマイクロスフェアーの懸濁液によく浸した。チューブを光軸に対して垂直な方向に向け、2.5×対物レンズを備えたZeiss Axiovert 35顕微鏡のステージに設置した。(C)コンピュータにダウンロードしたAmscopeソフトウェアを自動画像に設定し、Nafionチューブに対して形成される排除層(EZ)の画像を撮影した。

マイクロスフィアサスペンション

EZサイズ測定に用いた懸濁液は、ポリカルボキシレートコート0.5、1、2μm (Polysciences Inc; # 18327; 2.5% solids-latex) とポリスチレンコート1μm (Polysciences Inc; # 19814; 2.5% solid-latex, Warrington, PA) という2種類のマイクロスフェアからなるものであった。マイクロスフィアをBarnstead D3750 Nanopure Diamond精製システム、Dubuque、IA)から得た脱イオン(DI)水(タイプ1高速液体クロマトグラフィーグレード、18.2 MΩ)中に懸濁させた。ミクロスフィアとDI水の体積比は、実施する実験の種類に応じて1:100から1:1000の間とし、濃度差から生じる可能性のある影響を排除するために、各実験シリーズで一定に保った。

EZの測定

切断したナフィオンチューブをピンセットで保持し、シリンジで調製したマイクロスフェア溶液を気泡がなくなるまでチューブ内に注入した。その後、ピンセットでナフィオンチューブを操作し、35mm×10mmのファルコン社製シャーレに3~4mLのマイクロスフィア懸濁液を入れ、よく浸漬させた。また、Nafionチューブの切断片は、実験開始前に3~4mLの純水を入れた35 mm×10 mmのファルコン製シャーレに15~30分浸して水和させることもあった。対照EZの測定では、水和させたチューブを取り出し、微小球を含む3~4mLの純水が入った新しいシャーレに入れた。実験測定では、Nafionチューブの別のセグメントを、試験する懸濁液3~4mLに入れた(実験)。Nafionチューブを浸したシャーレを光軸に対して垂直方向に向け、2.5×対物レンズを備えたZeiss (Thornwood, NY) Axiovert 35顕微鏡のステージ上に蓋をして置いた(図1 C)。コンピュータにダウンロードしたAmscopeソフトウェア(バージョン:x64、3.1.615)を自動画像に設定し、Nafionチューブに対して形成されているEZの画像を撮影した。EZの測定はすべて、チューブと懸濁液が結合してから約15分後にEZの大きさが定常状態となった時点で行った。場合によっては、この時間を30分まで延長した。Image-J(バージョン1.49v)のグラフツールを用いて、Nafionチューブの両側でEZサイズを2〜6回測定し、そこから平均EZサイズを算出した。

機能性薬剤存在下でのEZの測定

ホーリーバジル、ターメリック、プロバイオティクス、ココナッツウォーターなど、様々な機能性薬剤がEZサイズに与える影響を検証した。これらの薬剤は、従来の生化学的手法やその他の手法によって確立されたように、健康を促進することが古くから認められている。また、医薬品として有効利用されている鎮痛剤であるアスピリンとタイレノールもリストに加えた。これらの薬剤はそれぞれEZの形成を促進し、ラウンドアップはEZを減少させることが予想された。各薬剤は、物質の重量または体積と人体内の水の重量/体積(約40〜45L)に基づき、人体内で予想される濃度を上回る濃度および下回る濃度で試験された6。

トゥルシー(ホーリーバジル)

Herb Pharm社(オレゴン州ウィリアムズ)からトゥルシー抽出物を入手した.この抽出液の原液(5mLを50mLの純水に溶解)を用いて、様々な希釈溶液(最大1×10-7倍希釈)を調製し、Nafionに対するEZ測定で独立に試験した。

Culturelle Kidsプロバイオティクス

水溶性プロバイオティクスパウダーは、臨床的によく知られている乳酸菌GGを1包あたり50億コロニー形成単位含んでった。すべてのプロバイオティクスの試用は、メーカー(Culturelle社)の推奨に従い、実験の直前に開封した新鮮なパケットを使用した。標準的なプロバイオティクス濃度は1 mg/40 mL(0.00125 g/100 mL)であった。我々は、純水100 mg/40 mL (0.25 g/100 mL)までの濃度範囲でプロバイオティクスを試験した。

ココナッツウォーター

純度100%のココナッツウォーター(Vita Coco.com)を純水で0.005%~10%の範囲になるように希釈した。

ターメリック

ターメリック(Curcuma longa)は、Nature Made社(カリフォルニア州ミッションヒルズ)から入手した。これは水に不溶である。そこで、ジメチルスルホキシド(DMSO)を用いてターメリックを溶解しやすくした。秤量したウコンをDMSOを含む純水(DMSOの最終濃度は純水中1%)に混ぜた後、溶液を10分間遠心分離して透明な溶液と残りを分離させた。上清をデカントし、通常のカルボン酸塩マイクロスフェアを用いた実験溶液を作製した。0.02~1.0 g/Lの範囲のウコン溶液がこの方法で調製された。

アスピリン

典型的なアスピリン錠(Premier Value, Gouverneur, NY)はアセチルサリチル酸を325 mg(1.8 mM)含んでおり、DI水中で広範囲の便利な濃度(0.45-45 mM)を調製するために使用された。

タイレノール

地元のドラッグストアにある「市販の」Tylenol(アセトアミノフェン)(小さじ1杯あたり160 mg、または5 mLと表示)を使って、0.09~14 mMの範囲でDI水によるフォーミュレーションを行った。これらの実験では、マイクロスフィアの濃度は5 mL DI水につき1滴であった。

ラウンドアップ

ラウンドアップ(Monsanto, St Louis, Missouri)は、有効成分グリホサート(全成分の2%)を含有する一般的に使用されている除草剤である。ラウンドアップの1%溶液(1.2 × 10-3 M)を純水で希釈し、1.2 × 10-14 Mまでの濃度に調整した。

データ収集と分析

排除帯の大きさは、上記のようにコントロールと各実験サンプルで測定した、ナフィオンチューブの片側または両側に沿った2~6回の測定値の共通平均値である。データはコントロールに対して正規化され、後者は実験サンプルが評価された日の数回の測定で平均化されることもあった。得られた商の値は、試験材料の濃度に対してプロットされた。3次多項式回帰を使用して、データポイントをフィッティングした。

結果

タルシ

結果(図2)は、Tulsi抽出物の低濃度(log v/v軸で-8から-4まで)において、EZサイズは当初、濃度依存的に増加したことを示している。高濃度(log v/v軸で-3から-1まで)では、排除帯の大きさは減少した。これらの結果は、低用量でトゥルシ抽出物はEZを著しく拡大させ、その結果、健康に大きな利益をもたらす可能性があることを示している。

図2.排除層(EZ)サイズに対するトゥルシの効果

各ポイントは、標準偏差(n;実験数=5)を持つ平均を表す。

Culturelle Kidsプロバイオティクス

その結果、約0.075g/100mLまではコントロールに対してEZサイズが着実に成長し、それを超えるとEZが減少することが確認された(図3)。

図3.排除帯(EZ)サイズに対するCulturelle

Kids Probioticの効果。各ポイントは、標準偏差を含む平均値を表す(n;実験数=3)


ココナッツウォーター

前回と同様、データは実験試料を試験した日に測定したコントロール値に関して正規化し、濃度に対してプロットした。その結果、純水中のココナッツ水の濃度が高くなるにつれてEZサイズが増加し、非常に広い濃度範囲(0.5%~1%まで)でコントロール値を上回った後、急速に減少することがわかった(図4)。

図4.排除層(EZ)サイズに対するココナッツウォーターの効果

各ポイントは標準偏差を含む平均値を表す(n;実験数=3-7)


ターメリック

データはコントロールに対して正規化され、濃度に対してプロットされた(図5)。0.02g/Lより低い濃度のウコン製剤は試験していないが、EZサイズは0.1g/Lまで増加し、その後濃度を上げると減少することが確認された(0.2-1g/L)。

図5.排除層(EZ)に対するウコンの効果

各ポイントは、標準偏差(n;実験数=7-10)を伴う平均値を表す


アスピリン

Nafionに隣接する近傍のコントロールに対する結果としてのマイクロスフィアフリーゾーン(EZ)サイズを、アスピリン濃度の対数に対してプロットした。その結果、アスピリンの濃度が低い場合(0.45〜4.5 mM)、EZサイズはコントロール値を上回り、高濃度ではコントロール値を下回ることが分かった(図6)。

図6.排除帯(EZ)サイズに対するアスピリンの効果

各ポイントは、標準偏差(n;実験数=5)を伴う平均を表す


タイレノール(アセトアミノフェン)

図7に示すデータは、比較的低濃度のタイレノール(0.09-4.54)

 

mM)でEZサイズが大きくなり、十分な高濃度でようやくサイズが縮小するという同様の傾向を示している


図7.排除層(EZ)サイズに対するタイレノールの影響

各ポイントは標準偏差を含む平均値を表す(n;実験数=10-20)


ラウンドアップ

ラウンドアップは、一般的な傾向の例外であった。濃度の上昇に伴い、EZサイズの漸進的な減少が観察された(図8)。どの濃度においても、EZサイズがコントロール値を超えることはなかった。

図8.排除層(EZ)に対するラウンドアップの影響

各ポイントは標準偏差を含む平均値を表す(n; 実験数 = 7-10)

考察

この研究の目的は、健康を促進することが知られている薬剤が、EZ水の蓄積を促進するかどうかを検証することであった。EZ水は、細胞内の緻密なマトリックスを含む親水性表面の隣に蓄積されるため、細胞内の水のほとんどは構造化された、すなわちEZである2,5。したがって、様々な健康増進剤の全体的な効果は、細胞内のEZ水の蓄積にあると考えられ、水はどこにでもあるので、健康全般に影響を与える可能性がある。本研究で取り上げた栄養補助食品と鎮痛剤は、かなりの濃度範囲でEZ水を生成することから、このことが証明された。一方、グリホサートを有効成分とする除草剤ラウンドアップは、EZの拡大が見られず、濃度の上昇とともにEZが確実に減少することが分かった。

この仮説の提案に関しては、いくつかの疑問が生じる。一つは、実験した物質が必ずしも健康増進につながるかどうかということだ。もう一つは、EZが拡大する濃度は、生体内で予想される濃度と一致するかどうかである。物質が摂取されると、濃度は上昇し始める。したがって、最小の濃度が関連性を持つはずである。物質が吸収され、代謝され、不均一に分布し、排泄されるため、より高い濃度がどの程度関連しているかを評価するのはそれほど簡単ではない。薬物動態学の全分野がこれらの問題に取り組んでおり、すべての答えが確実というわけではない7,8 。

ホーリーバジルは、Tulsiとしても知られ、Ocimum TenuiflorumまたはOcimum Sanctumとして知られるハーブに由来している。9-11 我々は、Ocimum tenuiflorumとOcimum gratissimumの葉から調製したトゥルシーの液体エキスを使用し、2オンス(約60mL)の水に対して0.7mLを目安に摂取している。これは、40 Lの水を持つ典型的な人体では0.5 µLにほぼ換算され、図2の-4と-5の濃度(log [v/v] )の間の領域に相当する。これらの濃度において、排除層が最も高くなることが観察された。

最も臨床的に研究されているプロバイオティクスであるCulturelle kids probioticは、乳製品、グルテン、砂糖を使用しておらず、子供の消化器官における善玉菌とそうでない菌のバランスを回復するのに役立つ。12 プロバイオティクスパックは、1グラム単位で摂取することが推奨されている。40 Lの水を持つ平均的な人間の体では、1 mg/40 mL(0.0025 g/100 mL)に換算される。このプロバイオティクスの存在下では、排除層は着実に増加し、0.125 g/100 mLでプラトーになった。濃度が高いほどEZは減少したが、推奨量の100倍の最高濃度(1 mg/40 mL)でも、コントロールよりも大きなEZが誘発された(図3)。このことから、非常に高濃度のプロバイオティクスであっても、EZを増幅する効果があることが示唆された。

ココナッツウォーターは、カリウムが非常に豊富で、ナトリウム、塩化物、炭水化物を含んでいる13。水分補給用の液体として使用され、14 抗酸化作用があることも報告されている15。人間が一度に摂取するココナッツウォーターの量は、通常約11オンス(325 mL)である。これは、一般的な人間の水量を40Lとして計算すると、0.8%に相当する。ココナッツウォーターの濃度が0.5%から1%以下(対数濃度軸で-2.3から-2、図4)で、ちょうどよい大きさのEZが得られた。

また、インドの一般家庭で毎日の料理に使われている、鮮やかな黄色の「万能スパイス」であるターメリックについても調査した。ウコンは、C longaの根茎に由来し、生薬としても評価されており、その抗酸化作用や抗炎症作用から、多くの疾患の予防や治療に応用できる可能性を秘めている16 。通常の摂取量は0.5 gの範囲にあり、これは40 Lの水を含む典型的な人体では、0.0125 g/Lと換算される。図5に示したデータは、0.02g/Lより低濃度のウコンの効果を示すものではないが、0.1g/Lという高濃度でも十分なEZを安全に得られる可能性があることを示している。

「1日1錠のアスピリンで医者いらず」と言われるように、過去2世紀にわたって世界中で最も広く使用されてきた薬物の1つであるアセチルサリチル酸17を研究し、その存在下でEZが成長するかどうかをテストしている。アスピリンは、痛み、発熱、腫れ、炎症を抑え、心臓発作、脳卒中、さらには特定の癌を予防することができる18。また、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、気分障害などの神経変性疾患と戦う役割を果たす可能性を示す証拠がある19, 20。これは、実験内容を若干変更した先行研究のデータと同等であった21,22。他の実験濃度は、この典型的な投与量に基づいている。その結果、45μMの10倍の濃度(0.45mM、対数濃度軸で-0.35に相当)から、100倍(4.5mM、対数濃度軸で0.65に相当)までは、それなりのEZを誘発し、それ以上の用量になると減少した(図6)。

23 我々は、地元のドラッグストアで購入した市販のタイレノールを使用したため、最大濃度は販売されている濃度(小さじ1杯、または5mLあたり160mg)に制限された。液体タイレノールの標準的な服用量が15mLであることを考えると、1回の服用で480mgのタイレノールが体内に送り込まれることになる。また、人体の平均的な水分が40Lであることから、0.078mMのタイレノールとなる。我々のデータは、試験したタイレノール濃度が2 mMまではEZサイズが着実に増加し(図7)、その後、高濃度(4.5~13 mM)で急速に減少することを示している。

一方、グリホサートはモンサント社からラウンドアップとして販売されている、2番目に人気のある除草剤で、最近注目されている。これは広域、非選択的、浸透性の除草剤で、現在では風土病の流行とよく関連している。24-27 環境保護庁(EPA)は、最大汚染物質レベル(MCL)と呼ばれるグリホサートの強制的規制値を 0.7 mg/L に設定しており、これは人体に存在する水に関してグリホサート 4.14 μM と換算される。この値は、試験溶液の対数濃度軸で-4(1.21 µM)と-5(0.121 µM)の間に位置しており、EPAの言う「許容MCLレベル」がEZのサイズを小さくする一方で、グリホサート濃度はMCLレベル以下でも以上でもEZを5倍減少させることがわかった(図8)。

つまり、試験したすべての健康増進物質は、体内で予想される濃度範囲内でEZ水の量を増加させるが、健康阻害物質はその逆であることがわかる。

では、なぜEZ水が増えると健康になるのだろうか?

健康は細胞の働きによって成り立つが、その働きはタンパク質の折り畳みに大きく依存する。筋細胞の収縮、分泌細胞の分泌、神経細胞の情報伝達など、細胞の種類によって、タンパク質のフォールディングは様々な機能を担っている。通常、タンパク質は単体で考えられているが、実は、タンパク質は界面(EZ)水に取り囲まれている5。

従って、タンパク質を取り巻く通常の微小環境はEZ水である。この界面水の融解がフォールディングの形成に必要であること、また、エネルギーに依存した水の再構築がアンフォールディングに付随して起こることが示唆されている2。EZ水が不足すると、タンパク質はその「正常な」環境から外れてしまい、ミスフォールディングを起こし、機能低下や病的な状態に陥ることが予想される28,29。

このような観点から、EZ水を回復させることで機能を回復させることができるという提案がなされている。したがって、EZ水を増やす物質は健康に有益であり、EZ水を減少させる物質は健康を損なうはずである。後者については、今回、除草剤ラウンドアップの有効成分であるグリホサートが、EZの形成を阻害することを発見した。30 麻酔薬は機能を阻害し、EZの蓄積を減少させることがわかった。一方、今回検討した生物機能を亢進させる薬剤は、すべてEZの拡大をもたらした。したがって、この結果は仮説を支持するものと思われる。この仮説の特筆すべき点は、これらの物質の多くがグローバルに、あるいはホリスティックに作用することだ。多様なシステムに影響を与えるということは、複数の作用機序を持つか、あるいは単一の作用機序が広く作用するかという2つの選択肢のどちらかを意味する。後者については、すべての細胞を満たしている「水」の可能性がある。そこで、薬剤と水の間に直接的な分子間相互作用はなくても、これらの多様な薬剤の作用によって、何らかの形でEZ水の蓄積が促進されるのではないかと考えている。

ナフィオンは分子構造中に酸素原子を含んでおり、EZウォーターハニカムの鋳型となるもので、親水性のあるナフィオンの表面からEZハニカム層を形成するために水が原料として使用される5。5 負に帯電した格子は、正に帯電したプロトンをEZ内に戻そうとするが、このプロトンが水分子に引っかかってヒドロニウムイオンを形成する可能性があるため、ハニカム層はOHユニットを格子内に一度にロックして形成される。通常、ヒドロニウムイオンが格子に入り込むことはないため、形成されたEZは良好な安定性を保つ。健康増進剤は、これらのプロセスの動態に影響を与え、さらにEZ層を形成することが明らかになった。適切な濃度であれば、すべての健康増進剤がEZ水を形成するという観察は、提案した仮説に合致している。また、オッカムのカミソリ(単純性の原則)も満たしている。

ここで注目すべきは、EZが大きな濃度範囲(通常、数百倍から数千倍)にわたって拡大することだ。このことは、相当な用量範囲にわたって有益な効果があることを意味している。一方、過剰投与では、EZの大きさが一貫して減少することがわかった。この特徴は、過剰投与による悪影響を説明するものと考えられる。例えば、アスピリンの過剰摂取は、一時期、自殺の手段として広く用いられたことがある。EZの拡大が健康を増進するのであれば、EZの縮小は健康を害することになる。

しかし、この現象は、健康増進、健康障害、健康中立のいずれであっても、我々の研究室でテストしたほぼすべての薬剤で起こるので、むしろ一般的なメカニズムである。おそらく、高濃度で各薬剤分子の周りに形成されるEZは、プロトンの産生を増幅させるのだろう。このプロトンはEZの格子に侵入することができ、その結果、EZの大きさが測定可能なほど小さくなるのである。これと他のメカニズムについては、さらに詳細な調査が必要である。

EZの拡大は、特にホリスティックな観点から、健康増進のための基本的なメカニズムである可能性があるようである。さらなる健康増進剤がこのパラダイムに当てはまるかどうか、興味深いところである。

まとめ

栄養補助食品と鎮痛剤は、かなりの濃度範囲でEZを拡大させることがわかった。この結果は、健康を促進する薬剤はEZも構築するという仮説と一致する。一方、健康を害する除草剤ラウンドアップは、濃度の上昇に伴いEZが確実に減少することが示された。

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