SARS-CoV-2による細胞シグナル伝達の障害

強調オフ

SARS-CoV2 治療標的・分子経路ウイルス学・その他のウイルス免疫

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Dysregulation of Cell Signaling by SARS-CoV-2

2020年12月19日

pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33451855/

ハイライト

  • 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)タンパク質は、宿主のシグナル伝達を調節して寛容な環境を作り出す。
  • SARS-CoV-2タンパク質は、細胞生理学、代謝、免疫活性化に関与するヒトのキナーゼ100種類以上をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする。
  • 特定のプロウイルス細胞シグナルを標的とすることで、宿主の微小環境をウイルスの複製に抵抗力のあるものにすることができる。
  • SARS-CoV-2の非構造タンパク質のほとんどは、免疫応答の調節障害に関与している。
    配列の相同性の違いから、NSP2は血清診断に重要であると考えられる。

病原体は、宿主の経路を利用して、その増殖のための寛容な環境を作り出す。現在、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)の感染が拡大しており、ウイルスを効果的に制御するためには、複雑な病原体と宿主の相互作用を理解することが急務となっている。SARS-CoV-2は、効率的な細胞侵入のために宿主の細胞骨格を再編成し、ウイルスタンパク質の翻訳をサポートするために宿主の転写プロセスを制御します。また、ウイルスは、様々な構造的および非構造的タンパク質を用いて、自然細胞防御を調節することができない。これは、弱められたインターフェロン(IFN)応答と並んで、実質的ではあるが遅延した高炎症の結果である。我々は、SARS-CoV-2とその独特の攻撃的なライフサイクルの概要を提供し、宿主のシグナル伝達経路と様々なウイルスタンパク質の相互作用について議論する。また、SARS-CoV-2タンパク質の機能的変化について、SARS-CoVと比較して考察する。SARS-CoV-2の発症における宿主シグナル伝達の包括的な評価は、世界的に急速に出現しつつあるこの危機に対する新規治療法の開発に向けて、複雑でありながらも重要な戦略的手がかりを提供するものである。

SARS-CoV-2の紹介

コロナウイルスは、コロナウイルス科コロナウイルス属に属する一本鎖RNA(ssRNA)ウイルスである。この科のウイルスは、2002年の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)、2019年のSARS-CoV-2、2012年の中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)の3つの大流行を世界的に引き起こしており、2015年と2018年には小規模な大流行が発生しています。2019年には、中国の武漢でSARS-CoV-2の大流行が発生し、その後、世界中に広がり、ほぼすべての国で症例が確認され、2020年11月30日時点で約7,300万人に感染し、1,627,046人以上の死亡が記録されています(https://www.worldometers.info/)。SARS-CoV-2配列の拡散、進化、系統解析により、研究者は、病原性の違いやウイルスの世界的な拡散に関連した変異パターンを調べるのに役立っている(図1)[1]。疫学的には強力な証拠があるにもかかわらず、宿主とウイルスの分子間相互作用はあまり研究されておらず、効率的なパンデミック対策には限界があります。

図1新規コロナウイルス重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2(SARS-CoV-2)のグローバルゲノム疫学

SARS-CoV と SARS-CoV-2 は共にコロナウイルスのβサブファミリーに属している.SARS-CoV-2は、プロテアーゼ、RNA依存性RNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼの16種類の非構造タンパク質を含む29種類のタンパク質から構成されています(表1、キーテーブル)[2]。また、13個のORFが構造タンパク質と9個のアクセサリーファクターをコードしている[2]。SARS-CoV-2は、SARS-CoVと約79%、MERS-CoVと約50%のゲノム類似性を有する[3]。疫学的データによると、SARS-CoV-2はSARS-CoV(9.6%)やMERS-CoV(35%)と比較して、感染率は最も高いが死亡率は最も小さい(2.3%)。SARS-CoV-2の感染率と病原性が高いのは,構造タンパク質と非構造タンパク質の遺伝子変化に起因すると考えられた.SARS-CoV-2の潜在的な分子標的を同定し、この壊滅的なウイルスに対する新規治療法を開発するためには、ウイルスが宿主細胞の経路や機能を利用して病気を引き起こすメカニズムを理解することが重要である。ここでは、ウイルスタンパク質のゲノム変異のいくつかを議論し、宿主細胞のシグナル伝達の調節におけるそれらの役割について考察する。

表1キーテーブル SARS-CoV-2ウイルスタンパク質の一般名と現在知られている機能の概要

 

ウイルスのライフサイクル

SARS-CoV-2のライフサイクルは、宿主プロテアーゼまたは膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)[4]によるウイルススパイク(S)タンパク質のプライミングから始まり、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合およびウイルスゲノムの細胞内への侵入を確実にする[5]。あるいは、SARS-CoV-2ウイルスは、アンジオテンシン変換酵素2(ACE2)受容体に付着した後、細胞によってエンドサイト化され得る。内部化されると、宿主酵素カテプシンLは、ウイルスゲノムの細胞内への同様の放出をもたらすSタンパク質を切断することができる[5]。

細胞内に入ると、ポジティブセンスssRNAゲノムは宿主リボソームを用いて翻訳される。一次ウイルス遺伝子ORF1abは、ポリタンパク質pp1aとpp1abをコードしており、このポリタンパク質は、それ自身からパパイン様プロテアーゼ(PLpro)と3C様プロテアーゼ(3CL-pro)を自動で分離する[6]。PLproはさらにウイルスポリプロテインを処理し、非構造タンパク質(NSP)1-3を放出し、3CL-proは残りのNSP4-16を放出する [6]。SARS-CoV-2の特定のNSPは、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)NSP12やヘリカーゼNSP13などのRNA複製複合体を形成している[7]。NSP10、13、14、16はmRNAのキャッピングに参加し、NSP10、14、15は初期ゲノムのプルーフリーディングを行っている[7]。ゲノムが複製されている間、NSP1、NSP3、NSP12-14、ORF3、ORF6、およびORF7a/bなどの複数のウイルスタンパク質は、自然免疫系、特に1型インターフェロン(IFN)経路を標的とすることにより、宿主免疫応答に拮抗する [8,9]。しかしながら、ウイルスは感染中に特定の宿主Toll様受容体(TLR)を活性化し、インターロイキン(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-7、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、IFN-γ、および腫瘍壊死因子α(TNF-α)を含む多数の炎症性サイトカインの放出を刺激する [10、11、12]。重症感染患者の末梢血を分析すると、CD4およびCD8 T細胞数は減少していたが、高活性化T細胞の分画は増加していた[13]。さらに、Tヘルパー(Th)17細胞、ペルフォリンおよびグラニュライシンを発現するCD8 T細胞の濃度が上昇しており、これらはいずれも炎症亢進に寄与していた[13]。宿主のTh17応答は、重症コロナウイルス病2019(COVID-19)感染症の特徴であるサイトカインストームへの主要な貢献者である[14]。
その後、ウイルス構造タンパク質とウイルスゲノムはウイルスに集合し、小胞を用いて宿主細胞表面に移動し、リソソーム、Arl8b依存性エキソサイトーシスを介して放出される[3,15]。宿主小胞体(ER)シャペロンであるGRP78/BiPは、ウイルスと一緒にコトラフィッキングされ、この過程でも放出されます[15]。あるいは、未熟なウイルスは、ヌクレオカプシド(N)タンパク質を使用して、細胞表面のグリコシル化エンベロープ(E)タンパク質に局在化する[16]。この相互作用により、ウイルスの再配向が可能となり、それに続いて宿主細胞からの出芽が起こる [16]。最後に、宿主小器官の破壊は、リソソーム内容物の放出につながり、細胞死とウイルスの子孫の放出を誘発します[17]。

SARS-CoV-2感染時の宿主シグナル伝達

感染の間、ウイルスは宿主の機械を利用して宿主に寛容な微小環境を作り出す傾向がある。SARS-CoV-2に感染したVero細胞のリン酸化プロテオーム解析により、97の細胞内キナーゼが制御されていることが明らかになった[18]。活性化されたキナーゼには、p38介在性シグナル伝達に関与するものや、グアノシン一リン酸依存性プロテインキナーゼなどが含まれる。ダウンレギュレーションされたキナーゼには、細胞増殖、細胞周期、細胞骨格調節因子に関与するものが含まれる。核内因子-κB(NF-ĸB)、単球特異的エンハンサー因子2C、およびc-Junなどの最も活性化された転写因子は、IL-6、TNF-α、CCL2、CCL20、およびCXCL8などの炎症性サイトカインの刺激を媒介することが知られているp38/MAPK(マイトジェン活性化プロテインキナーゼ)経路の下流にある[18]。さらに、S/G2転移時の細胞周期停止は、生産性の高いSARS-CoV-2感染と高い相関があるが、M期の進行は負の相関がある。感染中のS/G2停止は、ウイルス感染中のサイクリン依存性キナーゼ2(CDK2)活性の調節障害に起因する可能性がある[18]。研究では、SARS-CoV-2感染に対する宿主免疫応答の非定型的で遅延した誘導が発見されており、これはI型およびIII型IFN応答がない場合にウイルス複製を促進し、同時に高レベルのケモカインを誘導することがわかっている[19,20]。様々なレベルの疾患重症度を有する50人のCOVID-19患者のコホートを対象とした統合免疫解析により、NF-κBが炎症を部分的に駆動することが示されている。このような炎症反応は、TNF-αおよびIL-6シグナル伝達の増加の結果である[19]。最近の研究によると、TNF-αとIFN-γは、ピロプトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスを含む細胞死の異なるモード間の広範なクロストークを介して、炎症性細胞死と組織損傷を誘導することが示されており、これらは総称してPANoptosisと呼ばれています[21]。TNF-αとIFN-γの組み合わせによる治療は、ヤヌスキナーゼ(JAK)/STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)/IRF1(interferon regulatory factor 1)軸を活性化し、カスパーゼ-8/FADD媒介のPANoptosisを駆動する一酸化窒素産生を導くことが明らかになった。興味深いことに、TNF-αとIFN-γは一緒にマウスでSARS-CoV-2様サイトカインの嵐を誘発し、これはPANoptosis阻害剤を使用して反転させることができます。さらに、SARS-CoV-2感染マウスをTNF-αおよびIFN-γに対する中和抗体で治療すると、マウスは死から保護される。このことは、サイトカインを介した炎症性細胞死シグナル伝達経路の臨床的意義を強調している。

構造タンパク質

SARS-CoV-2は5つの構造タンパク質をコードしている。(i) スパイク、(ii) エンベロープ、(iii) 膜、(iv) ヌクレオキャプシド。

スパイク蛋白質

SARS-CoV-2 の S タンパク質は、主にウイルスの侵入に関与している。メカニズム的には、Sタンパク質はその受容体結合ドメイン(RBD)を用いてヒトヘパラン硫酸(HS)およびACE2に結合し、ヒトプロテアーゼによって活性化されるが、SARS-CoVとは異なり、SARS-CoV-2の細胞侵入は、プロタンパク質変換酵素フリンによって事前に活性化されるため、宿主プロテアーゼへの依存度は低い[22]。SARS-CoV-2の感染速度は、そのSタンパク質の非常に可変性の高いRBDの構造の違いに起因していると考えられる(Box 1)。SARS-CoV-2の他の多くのタンパク質とは異なり、SARS-CoV-2のSタンパク質はIFN-βの活性化を増幅する [9]。Hsuらによるプレプリントは、SARS-CoV-2のSタンパク質がACE2受容体との結合を介して宿主の高炎症反応に寄与していることを示唆している[23]。この相互作用はMAPK-NF-ĸB軸を刺激し、TNF-αやCCL2などの炎症性サイトカインの放出をもたらす。MyD88およびTRIFは、このシグナル伝達経路が機能するために重要なアダプター分子である。さらに、S-ACE2相互作用からの下流のシグナル伝達は、ERストレスを増加させ、アンフォールドタンパク応答とNF-ĸBの活性化を引き起こす。これらの結果はプレプリントからのものであり、注意して見るべきであるが、より古い研究では、SARS-CoVのSタンパク質がNF-ĸBシグナル伝達の活性化を同様に誘導することを発見している[24]。Sタンパク質による炎症性サイトカインの誘導は、サイトカインの嵐、およびCOVID-19患者で観察された関連する上皮損傷および臓器損傷に寄与している可能性がある。

ボックス1

SARS-CoV-2のスパイク蛋白質変異

構造的には、12個のヌクレオチド挿入に加えて、SARS-CoV-2のRBDのアミノ酸変異は、L455、F486、Q493、S494、N501、およびY505を含む。これらの変更は、結合部位周辺の3-O結合糖鎖の増加をもたらし、その結果、ヒト受容体ACE2に対するより高い結合親和性をもたらす。アミノ酸変化D614Gを有する変異体は、最近、SARS-CoV-2の感染性を高めることが示唆されている[95]。


ACE2に加えて、初期の細胞接着およびウイルスの侵入における細胞表面HSの重要性を指摘する証拠が増えている[25]。Sタンパク質(Kd 55 nM)のHSへのより高い結合親和性は、RBD(Kd 1 μM)と比較して、HS模倣薬であるヘパリン、または可溶性HSが、宿主細胞におけるウイルスの侵入をブロックするために使用できることを示唆している[26]。HSはヒト細胞上にユビキタスに存在する複雑なグリコサミノグリカンであり、炎症、細胞通信、微生物の侵入などの主要な細胞プロセスに関与していることが文書化されている[27,28]。HS 分解酵素ヘパラナーゼ(HPSE)の強力なプロウイルス作用を示す最近の証拠から、HS は SARS-CoV-2 ウイルスの侵入を研究するための有望なシステムであると考えられている [29]。

エンベロープと膜タンパク質

エンベロープ(E)およびメンブレン(M)タンパク質は、SARS-CoV-2ウイルスのエンベロープの重要な構成要素である。配列比較の結果、これらのタンパク質はSARS-CoV-2ウイルスのエンベロープと非常によく似ていることが明らかになった[9]。興味深いことに、Eタンパク質とMタンパク質はコウモリコロナウイルスとパンゴリンコロナウイルスの間でほぼ同一である。また、Mタンパク質はIFN-βの活性化を独立して阻害し、Eタンパク質はインターフェロン刺激遺伝子(ISG)の転写を刺激する[9]。

ヌクレオカプシド(ORF9/9a)タンパク質

ヌクレオカプシド(N)は、翻訳調節因子であるリボヌクレオタンパク質 LARP1 を脱リン酸化することで、宿主タンパク質の合成と競合し、mRNA の未翻訳領域に結合することができる。興味深いことに、SARS-CoV Nタンパク質の過剰発現は、アクチン重合を誘導するカゼインキナーゼ2活性をアップレギュレートし、それによってウイルス感染に一般的に関連するプロセスである細胞骨格の組織化を制御する [30]。SARS-CoVのNタンパク質はまた、CDK2を阻害することにより、Nタンパク質と直接結合することにより、またはCDK2、サイクリンE、およびサイクリンAのタンパク質レベルをダウンレギュレートすることにより、S期の進行を阻害する[31]。ORF9アイソフォームに関する更なる情報は、ボックス2に記載されている。

ボックス2

ORF9bとORF9cの機能

これら2つのタンパク質の機能は、現在までのところ文献ではほとんど情報が得られておらず、不明な点が多い。SARS-CoVでは、ORF9bはミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質(MAVS)と下流のメディエーターであるTRAF3およびTRAF6との間のリンクを切断することにより、タイプIFNシグナル伝達を抑制する[96]。生理的なミトコンドリアの分裂に関与するダイナミン関連タンパク質(DRP1)は、ORF9bの過剰発現により発現が低下し、ミトコンドリアの伸長をもたらすことが明らかにされている[96]。このタンパク質に関する最近の研究は限られているが、ウイルスタンパク質の宿主タンパク質相互作用を理解することを目的とした初期の研究では、SARS-CoV-2のORF9bは複数のMAPキナーゼに結合することで細胞増殖に影響を与え、ORF9cは電子輸送に関与するいくつかのタンパク質に結合することが示唆されている[2]。興味深いことに、SARS-CoV-2 ORF9cは真のオープンリーディングフレームではないかもしれないし、解析された複数の臨床分離株がORF配列に早熟な停止コドンを含んでいるため、ウイルスの複製に必要ではないかもしれない[2]。


非構造タンパク質

SARS-CoV-2は16個のNSPをコードしており、これらのNSPは協力して複合体を形成し、その機能を実行している。ここでは、ウイルスのライフサイクルにおけるこれらのNSPの役割を、ウイルスによって発現される特定のアクセサリーORFタンパク質とともに概説する。SARS-CoV-2に関する研究は比較的少ないため、SARS-CoVとSARS-CoV-2の両方におけるこれらのタンパク質の概要を示す。ただし、SARS-CoVに関する情報はそのような情報として認識されなければならず、SARS-CoV-2に適用する場合には注意が必要である。

NSP1

SARS-CoV-2 NSP1は、SARS-CoVと85%の配列同一性を共有し、感染に対する宿主応答を中和するのに役立つ。HEK293T細胞をIFN-αで刺激すると、SARS-CoV-2 NSP1はSTAT1のリン酸化を阻害し、それによって下流のIFN-α媒介シグナル伝達を抑制する。さらに、NSP1はHEK293T細胞においてもIFN-β産生を抑制する[9,32]。NSP1はIRF3の上流および下流の両方のタンパク質を阻害している可能性が高いため、このメカニズムはあまり明らかではない。SARS-CoVおよびMERS-CoVで見られるNSP1の変異は、1型IFN応答を阻害する能力を向上させるようである[8]。

SARS-CoVのNSP1には複数の役割が発見されており、これはSARS-CoV-2のNSP1の変異体にも当てはまる可能性がある。SARS-CoVのNSP1は、リボソームの40Sサブユニットに結合することで宿主の翻訳プロセスを阻害する [33]。NSP1はまた、宿主エンドヌクレアーゼをリクルートして、宿主mRNA配列の5′-UTR(翻訳されていない領域)領域に切断を生じさせ、その後、Xrn1が媒介する方法で分解される [34]。興味深いことに、ウイルスmRNAは5′-UTR領域にリーダー配列を有しており、それはエンドヌクレオロジー切断に対する保護を与え、ウイルスタンパク質の選択的翻訳を促進する[35]。SARS-CoVのNSP1の変異は宿主のIFN応答をブロックする能力を危うくし、NSP1がインターフェロン応答因子(IRF)-3、IRF7、およびc-Junシグナル伝達と相互作用することを示唆している[36]。SARS-CoVおよびSARS-CoV-2の両方のNSP1は、宿主免疫応答をネガティブに調節するように機能する。

NSP2

NSP2 は 638 個のアミノ酸からなり、SARS-CoV の相同体とは 68%の配列相同性しかない。エンドソーム関連タンパク質様ドメインの1つの変異がSARS-CoV-2の伝染性の増加に寄与していることが示唆されている[37]。NSP2は、IFN-βの活性化を有意に促進する数少ないSARS-CoV-2タンパク質の一つである[9]。SARS-CoV-2では確認されていないが、SARS-CoVのNSP2は宿主タンパク質である prohibitin 1および2と相互作用し、細胞周期の進行およびアポトーシスを混乱させる[38]。NSP2は、Wiskott-Aldrich症候群タンパク質および瘢痕相同性(WASH)複合体の構成要素であるStrumpellinと相互作用することが示されている[2]。ストランペリンは、細胞内小胞上のアクチンアセンブリを調節することが知られており、ウイルスの脱出に役立つ可能性があります[2,39]。SARS-CoV-2のNSP2は、SARS-CoVと比較して配列相同性が異なることから、さらなる研究が必要であると考えられる。

NSP3

NSP3は、SARS-CoV-2のライフサイクルにおいて多面的な役割を果たす大型のマルチドメインタンパク質である。SARS-CoV-2のNSP3はIFN-βの活性化を遅らせ、ウイルスが安全に複製するためのより多くの時間を可能にする[9]。しかし、SARS-CoVのNSP3はIFN応答のはるかに強力な阻害剤であり、同様にタンパク質をより効率的に脱ユビキチン化することができた[40]。NSP3は、レプリカーゼポリプロテインを切断し、NSP1、NSP2、およびNSP3を遊離させるパパイン様プロテアーゼ(PLpro)ドメインを含む[6]。SARS-CoV PLproは、自然免疫応答の多くのコンポーネントを阻害することが実証されており、特に、刺激因子であるインターフェロン遺伝子(STING)-TRAF3(TNF受容体関連因子3)-TBK1(Tank-binding kinase 1)複合体との相互作用およびp53の分解を介したタイプIFNシグナル伝達の阻害によって、IFNシグナル伝達を阻害することが示されている[41,42]。SARS-CoV PLproはまた、TRAF3およびTRAF6に結合したLys63結合ユビキチンの除去を介してTLR7を介したサイトカイン誘導を阻害する[43]。NSP3のマクロドメイン(Xドメインと呼ばれる)は、コロナウイルス複製複合体の必須構成要素を形成している。Xドメインから得られるタンパク質はまた、標的タンパク質からADP-リボースを除去することにより、タイプIFN、ISG、およびサイトカイン応答を阻害する [44]。ADP-リボシル化されたタンパク質は様々な免疫応答を刺激することができ、多くのウイルスが宿主タンパク質からADP-リボースを除去して宿主免疫を回避することができるタンパク質をコードしていることが判明している[44]。これらの結果から、SARS-CoV-2 PLproはSTINGおよびTLR7シグナル伝達経路と相互作用して宿主免疫応答を調節できない可能性がある。

NSP4

NSP4は、ウイルス性ポリタンパク質pp1aおよびpp1abが切断される際に放出されるウイルス性タンパク質の一つである[45]。SARS-CoV-2 NSP4の情報は少ないが、80%近くの配列類似性を有していることから、SARS-CoV変異体と同様の役割を果たしている可能性があると考えられる[9]。SARS-CoVタンパク質の構造モデルは、複数の膜貫通ドメインを持つことを示唆している[46]。SARS-CoVタンパク質は、放出後早期に、小胞体膜との相互作用によりN-グリコシル化される。SARS-CoV NSP4の内腔ループに位置する2つのドメインは、NSP3と相互作用してERから核周囲領域に移動する [47]。SARS-CoVのNSP4(アミノ酸残基H120およびF120)は、ウイルスの複製および転写複合体(RTC)形成を促進するための膜再配列に関与している。

NSP5

NSP5はSARS-CoV-2の主要なプロテアーゼであり、3CL-proはその機能性ドメインである[2]。このタンパク質は、BAT-SL-CovZXC21およびSARS-CoVとそれぞれ99%および96%の類似性を示している[48]。NSP5はエピジェネティックおよび遺伝子発現調節因子として作用し、ERおよびミトコンドリアの機能にも影響を与えることができる。蛋白質インタラクトーム研究では、SARS-CoV-2のNSP5はヒストン脱アセチル化酵素2(HDAC2)と相互作用し、核内への移動を制限して自然抗ウイルス免疫を阻害し、ACE2を介した細胞侵入を促進した可能性がある[2,49,50]。また、触媒的に不活性なNSP5は、核内およびミトコンドリアのtRNA上のグアノシンをジメチル化するtRNAメチルトランスフェラーゼと相互作用することが研究で明らかになっている[2]。SARS-CoV-2のNSP5はTRMT1の切断を仲介し、ジンクフィンガードメインと核局在化配列を失う可能性がある[2,51]。さらに、遺伝子オントロジーデータから、NSP5_C145Aは細胞膜マトリックスの制御、細胞死、酸化ストレスへの応答、機械的刺激の知覚に関与していることが予測される。

NSP6

SARS-CoV-2 NSP6は、宿主タイプ1のIFN応答の強力な阻害剤である[8]。NSP6はTBK1と相互作用して、IFN-βの刺激のための必須条件であるIRF3のリン酸化を抑制する[8]。興味深いことに、SARS-CoVのNSP6はタイプIのIFN応答を阻害しない[8]。NSP6の進化分析は、SARS-CoV-2タンパク質の安定性を維持するために重要な変異を指摘しており、その結果、免疫抑制における後天的な役割に寄与している[52]。しかしながら、ある研究では、SARS-CoV-2のNSP6がインターフェロン刺激応答エレメント(ISRE)およびISG56のプロモーターを刺激したことが報告されている[9]。代わりにSARS-CoVのNSP6は宿主のオートファジーの阻害に重要な役割を果たしていることが報告された。SARS-CoVのNSP6は、感染細胞のオートファゴソームの直径を減少させることで、宿主のオートファゴソームの拡大を制限していた[53]。コロナウイルス感染性気管支炎ウイルス(IBV)のNSP6は、オートファゴソーム複合体を形成するタンパク質がリクルートされる部位であるオメガスソームの拡張を制限することが知られている[53]。さらに、IBV NSP6は、哺乳類のラパマイシン標的(mTOR)とリソソソームとの関連を阻害することが知られている[53]。これらの知見を考えると、SARS-CoV-2のNSP6は宿主のオートファジーを阻害するという未知の役割を持っている可能性がある。

NSP7およびNSP8

NSP7とNSP8はともにSARS-CoV-2とSARS-CoVの間で高度に保存されている。SARS-CoV-2のNSP7はSARS-CoVのNSP7と98.8%の配列類似度を共有しているが、SARS-CoV-2のNSP8は97.5%保存されており、それぞれ98.8%および97.5%の類似度を有している。したがって、SARS-CoV-2のNSP7およびNSP8は、SARS-CoVと同様の役割を果たしている可能性が高い。SARS-CoVのNSP8は22-KDのタンパク質であり、NSP7と複合体を形成してRNAプリマーゼとして作用する[54]。SARS-CoVでは、NSP7+8複合体はRNAに効率的に結合し、プライマーをテンプレート長まで伸長させることができる[54]。この複合体の最適な活性には、(補酵素としての)マグネシウムイオンと塩基性pHが必要である[54]。この複合体はまた、間接的にウイルスゲノムの複製を促進する。RNA複製を開始するためには、RdRp NSP12が最初にプリマーゼ複合体と結合し、NSP14がそれに続く。SARS-CoVのNSP14は、新しく合成されたウイルスRNAのプルーフリーディングに関与する重要な酵素である[55]。NSP8は、リボヌクレオタンパク質7(LARP7)、M期ホスホタンパク質10、およびサイトカイン誘導タンパク質と相互作用する。LARP7は、ウイルス遺伝子の転写を制御することが示されている転写アセンブリの重要な部分である[18,56]。SARS-CoV-2 NSP7のRasホモロジーファミリーメンバーA(RHOA)との相互作用は、Rho GTPasesのダウンレギュレーション、およびPAK1/2キナーゼによるvimentinおよびstathminタンパク質のリン酸化に寄与する可能性がある[18]。ヴィミンミンおよびスタスミンはともに細胞骨格の組織化に関与していることが知られている。さらに、SARS-CoV-2 NSP7は、他のNSPとは独立してIFN-αシグナル伝達を阻害することが実証された[8]。

NSP9

SARS-CoV-2のNSP9はRNA結合ホスファターゼとして機能し、RTCに参加している[57]。SARS-CoVのNSP9とは97.3%の配列相同性がある。SARS-CoV NSP9の構造は、複製中にウイルスRNAを安定化させ、RNA処理を助ける可能性を示唆している[58]。複製中、SARS-CoV NSP9は、GXXXGモチーフを持つ2つのαヘリックスの結合を介して二量体化するが、これはコロナウイルスの複製に必要なステップである[59]。興味深いことに、SARS-COV-2 NSP9は宿主タイプ1 IFN応答の刺激因子である[9]。

NSP10およびNSP16

SARS-CoV-2のNSP10は、SARS-CoVの相同体と高度に保存されている[9]。SARS-CoVのNSP10は、コロナウイルスのライフサイクル中にNSP16と複合体を形成する [60]。NSP10は2-O-メチルトランスフェラーゼNSP16に結合し、活性化する[60]。この複合体はウイルスRNAの5′グアノシンキャップをメチル化し、これはRIG-Iなどの宿主細胞質RNAを認識する分子からの検出を回避するのに役立つ[61]。SARS-CoV NSP10+16複合体のこの免疫回避能力は、IFN応答の活性化を妨げる[60]。NSP10+16相互作用の喪失は、ウイルス複製の阻害をもたらし、複合体の形成がSARS-CoVのライフサイクルにおいて必須のステップであることを示唆している[62]。さらに、SARS-CoVのNSP10は、NSP14との複合体において活性化補因子として作用する。それは、NSP14が新しく合成されたRNAを校正し、編集することを可能にする[63]。NSP7+8+12複合体とNSP10はそれぞれ、エキソリボヌクレアーゼが最適に機能するように調節する役割を果たしていると考えられる。

NSP11

SARS-CoV-2 NSP11は、3CL-proによるpp1aの処理に起因する小さな切断産物である[64]。その完全な13アミノ酸配列は以下の通りである。SADAQSFLNGFAV [65]。NSP11-16の翻訳に必要なORF1bのリボソームフレームシフトでは、NSP12のN末端となる。NSP11については、現在のところ独立した機能は記述されていない [64]。

NSP12

NSP12はSARS-CoV-2のRdRpであり、ウイルスの複製に不可欠である。NSP12は、活性化に先立って、その補因子NSP7およびNSP8とポリメラーゼ複合体を形成しなければならない[66]。NSP7+8はプライマーゼとして機能し、NSP12のRNA結合能を向上させ、これはSARS-CoV-2ゲノムを複製するためのその後のポリメラーゼ活性を促進する[66]。センダイウイルス感染前にNSP12プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクションすると、IFN-β活性化が有意に阻害された[9]。しかし、NSP12はまた、ISREおよびISG56を刺激し、宿主免疫応答との微妙な関係がある可能性を示唆している[9]。SARS-CoV-2 NSP12は、SARS-CoV NSP12と比較すると、酵素活性および耐熱性が低下していることが示されている[67]。SARS-CoV-2に対する臨床使用で人気を博している実験薬レムデシビルは、NSP12と結合することでSARS-CoV-2を阻害すると考えられている[62,68]。さらに、Ruanらは、NSP7+8+12複合体に強い結合親和性を示す8つの追加化合物を発見した[69]。NSP12は、リボヌクレオタンパク質4B、CREB制御転写活性化因子3、E3ユビキチンタンパク質リガーゼ、ユビキチン関連タンパク質2、およびPLAKHA5と相互作用することが知られている。多くのSARS-CoV-2 NSP12と相互作用するタンパク質は、ウイルスタンパク質の過剰発現によりリン酸化が減少することを示している[18]。

NSP13

NSP13はSARS-CoV-2ヘリカーゼであり、SARS-CoVのカウンターパートと同一である[48]。したがって、SARS-CoVのNSP13に関する情報はSARS-CoV-2への適用性が高い。SARS-CoV NSP13は、ATP加水分解を利用して、5′一本鎖の尾を5′-3′方向に持つ二重鎖DNAおよびRNAを巻き戻し、それによってウイルスの複製に重要な役割を果たしている[70,71]。一般に、SARS-CoV NSP13の二重鎖RNAアンワインド活性は、二重鎖DNAアンワインドに比べて効率が悪い[71]。しかし、ATP濃度の増加に伴い、二重鎖RNAは、SARS-CoV-2 NSP13のヘリカーゼ活性のための好ましい基質となり、その結果、二重鎖RNAの巻き戻しにおいて、DNAと比較して高い処理能力を有するようになる[72]。ここで、ATPはヘリカーゼの構造変化を引き起こし、ヘリカーゼのRNAへの親和性をそらす。この研究により、著者らは、ATPの利用可能性が、SARS-CoV-2 NSP13の巻き戻し、移動、およびその基質(二重DNAまたはRNA)からの解離に影響を与える可能性があると結論付けている。Adedejiらはさらに、RdRp(SARS-CoV由来のNSP12)がSARS-CoV NSP13の触媒効果を2倍に高めることを示唆している[73]。NSP6と同様に、SARS-CoV-2由来のNSP13もまた、IRF3とTBK1の両方のリン酸化を阻害することにより、HEK293T細胞におけるIFN-βの活性化を阻害する[8,9,40]。NSP13もまた、HEK293T細胞におけるIFN-α媒介シグナル伝達を阻害する[8]。このように、SARS-CoV-2のNSP13は、ヘリカーゼとしての役割と1型IFN応答の阻害剤としての二重の役割を果たしている。

NSP14

SARS-CoV NSP14は、7、8、10および12のような他のNSPと相互作用することが示されている[46,74]。その主要な役割は、NSP10との最初の相互作用時に3′-5′-エキソリボヌクレアーゼとして機能することである。一旦活性化されると、それはウイルスゲノムを校正し、それが遭遇した任意の誤ったヌクレオチドを除去する。コロナウイルスマウス肝炎ウイルスでは、NSP14の突然変異はゲノム突然変異の15倍の増加をもたらし、複製の忠実性においてNSPが果たす本質的な役割を強調しています[75]。同様に、SARS-CoVの変異したNSP14は、ゲノム変異の21倍の増加を示した[75]。さらに、SARS-CoVのNSP14は(グアニン-N7)-メチルトランスフェラーゼとして機能し、新しく合成されたウイルスRNAを分解から保護することができる。そのキャッピング機能は、エキソリボヌクレアーゼドメインの存在を必要とするが、ドメインの酵素活性は無視できない[76]。最後に、SARS-CoV-2 NSP14は、IRF3の核内局在化を阻害することにより、IFN-β産生およびシグナル伝達を阻害することが示されている[9,40]。
SARS-CoVのNSP14はまた、NSP7+8+12複合体に結合することができるが、結合した場合にはエキソリボヌクレアーゼ活性を欠く[55]。しかし、NSP10を複製複合体に加えると、SARS-CoV NSP14はその活性を回復する[55]。NSP7、8、および12と並んで、NSP14は、プリマーゼ、ポリメラーゼ、およびエキソリボヌクレアーゼの機能を持つタンパク質のスーパーコンプレックスの別のユニットとして機能している可能性がある。

NSP15

SARS-CoV NSP15はエンドリボヌクレアーゼとして作用し、RNAヌクレオチドをウリジル酸塩の3′方向に切断する[77]。NSP15の構造は、マンガンカチオンの存在に対して非常に敏感である[78]。活性部位の外側を含むSARS-CoV NSP15の変異は、ウイルス感染を阻害する[79]。NSP13および14と同様に、SARS-CoV-2 NSP15はまた、IRF3の核への局在化を阻害することにより、感染中の宿主IFN応答を妨害することができる[40]。興味深いことに、SARS-CoVのNSP15は、網膜芽細胞腫タンパク質pRbに結合可能な小さなドメインを含んでいる[80]。NSP15はHuh-7細胞におけるpRbの分布を変化させ、細胞質と核内のpRbの比率を増加させる[80]。Rb発現の低下は、NSP15を導入した細胞の細胞周期進行の変化をもたらす[80]。このように、NSP15はエンドリボヌクレアーゼ、IFN阻害剤、およびpRbの結合パートナーとして多面的な役割を発揮する。

ORF3a

ORF3aは、ORF8aおよびEタンパク質と並んで、SARS-CoVによってコードされるイオンチャネルタンパク質である[81]。SARS-CoV-2では、ORF3aはSTAT1のリン酸化を抑制することによりIFN-αシグナル伝達を阻害することが実証されている[8]。別の研究では、ORF3が同様にIFN-βシグナル伝達を阻害し、1型IFN応答の強力な阻害剤となりうることが明らかになった[9]。最近では、ORF3aはリソソームの脱酸に関与していると考えられている[15]。リソソソームのpHを上昇させることで、ウイルスはリソソソーム小器官を乗り物として利用して形質膜に到達し、宿主細胞から脱出することができるようになる[15]。SARS-CoVのORF3aは3つの膜貫通ドメインを持ち、ウイルスの組み立て中にMおよびEタンパク質と相互作用する[82]。ORF3aはまた、PDZ結合モチーフを含んでおり、これは数百の細胞タンパク質に結合し、シグナル伝達を調節することを可能にしていると考えられる[82]。ORF3aを欠損したSARS-CoVウイルスは、in vitroおよびin vivoの両方で複製の欠陥を示す[82]。ORF3aのPDZ結合モチーフを欠いたウイルスは正常に複製し、ORF3aの他のドメインが複製に必須である可能性を示唆している[82]。しかし、Eタンパク質が存在しない場合、PDZ結合モチーフは複製に必須となる[82]。Eタンパク質とORF3aの間の相互作用は、ウイルスの複製サイクルに大きな影響を及ぼす。ORF3aはEタンパク質との相互作用とは無関係にサイトカイン応答に関与している(Box 3)。

ボックス3

ORF3aはサイトカインストーム誘導に関与している

SARS-CoV ORF3aは、Eタンパク質との相互作用とは無関係に、サイトカインストームの誘導にも関与している。この経路では、TRAF3がその重要な結合パートナーとして作用する。ORF3aとTRAF3の相互作用はNF-ĸBの活性化をもたらし、これはIL-1βの発現と分泌をアップレギュレートさせる[97]。さらに、SARS-CoVのORF3aの発現は、TRAF3によって再び媒介されるプロセスであるカスパーゼリクルートドメイン(ASC)を含むアポトーシス関連スペックク様タンパク質のユビキチン化を導く[98]。NOD-、LRR-、およびパイリンドメイン含有タンパク質3(NLRP3)を発現する細胞におけるASCのユビキチン化は、カスパーゼ-1およびIL-1βの成熟を活性化する[98]。ORF3aはIL-1βのアップレギュレーションと成熟に関与しているため、NLRP3のインフルマソームの形成とサイトカインストームの誘導を刺激する。SARS-CoVにおけるこれらの知見から、SARS-CoV-2のORF3aは感染時にもサイトカインストームを誘導する可能性があると考えられる。


ORF6

ORF6は、SARS-CoVとSARS-CoV-2の間で最も保存されていないタンパク質であり、配列類似度はわずか66.6%である[9]。SARS-CoVのNSP8は、細胞質のパンクテート構造においてORF6とコロケーションする[83]。ORF6はNSP8と結合するが、ORF6を欠失した変異体は野生型ウイルスと同様の複製速度を示す [84]。SARS-CoVのORF6はカリオフェリンα2およびβ1とER/ゴルジ膜に結合し、それらが核輸入複合体を形成するのを阻止する [85]。さらに、SARS-CoV ORF6はNUP98/RAE複合体と相互作用することが知られており、S888部位でのNUP98のリン酸化の増加と相関している。これは、宿主mRNAの核輸出を妨げ、その結果、宿主タンパク質合成の阻害をもたらす[86]。C末端は、テザリングが起こるためのタンパク質の必須領域であるようである[85]。IFNシグナル伝達が活性化されると、核内輸入の喪失により、STAT1が核内に入ることができず、下流のSTAT1シグナル伝達が阻害される[85]。これらの知見に関連して、SARS-CoV感染は、STAT1ノックアウトマウスにおける高ウイルス力価の迅速な産生をもたらす[87]。コロナウイルス感染のクリアランスにおけるSTAT1シグナル伝達の本質的な役割を考えると、ORF6は抗ウイルス性IFNシグナル伝達の阻害剤として重要な役割を果たしている。

これらの知見を裏付けるように、最近の研究では、SARS-CoV-2 ORF6がIFN-β媒介のIFN応答の抑制に関与していることが示唆されている[8,9,40]。ORF6は核内輸入因子であるカリオフェリンαに結合し、IRF3の核内への転座を阻止して、その後のIFN-βの産生を停止させる[8]。さらに、ORF6のC末端のアミノ酸53〜61は、ORF6がSTAT1の核内転座を阻害するのに十分であり、それによってISREおよびISG56プロモーターの活性を低下させる[9]。

ORF7a/b

ORF7aと7bはSARS-CoV-2の付属タンパク質である。ORF7aおよびORF7bの両方とも、タイプ1のIFN応答を阻害するが、それらはわずかに異なるメカニズムを介してそれを行う。ORF7aはSTAT2のリン酸化を阻害するが、ORF7bはSTAT1とSTAT2の両方のリン酸化を阻害する[8]。SARS-CoV-2 ORF7aおよび7bは、STATタンパク質の核への転座およびその後のISGの転写を阻害する。1型IFN応答を阻害する無数のSARS-CoV-2タンパク質を考えると、特定のIFNの外因性添加はウイルス産生を抑制する可能性がある。IFN-βの予防的治療は、SARS-CoV-2に感染したCalu-3細胞におけるウイルス複製を制限するのに十分であることが証明された[9]。

ORF8

ORF8はいくつかのハイパーバリアブル領域を含み、SARS-CoVとの相同性が最も小さいタンパク質の一つを構成している[78]。ORF8はまた、タイプIFN系の重要な阻害因子としても機能する。SARS-CoV-2 ORF8の過剰発現は、IFN-βプロモーターの活性化を用量依存的に阻害する結果となった[88]。そのIFN阻害活性はMHC-Iのダウンレギュレーションに起因する可能性がある[89]。Zhangらは、293T細胞においてORF8を過剰発現させると、ヒト白血球抗原(HLA)-A2のダウンレギュレーションが観察された。SARS-CoV-2のORF8は、急速な突然変異と進化により、免疫回避病原性因子として機能している可能性がある[90]。様々な地理的地域から分離された異種臨床分離株は、非常に可変性の高いORF8およびORF14配列を有することが確認されている[91., 92., 93.]。Kakhkiらは、ORF8の配列にはSARS-CoV-2に完全に特異的な塩基配列が含まれていることから、ORF8が優れた検出ターゲットとなる可能性があると提案している[94]。

おわりに

最初の発生から20年が経過した現在、SARS-CoVの標準化された治療法は存在しない。したがって、SARS-CoV-2 のようなβ-コロナウイルス感染症の効果的な治療法を開発するためには、多くの綿密な研究が必要とされている。本レビューでは、SARS-CoV-2のライフサイクルの概要、主要タンパク質の具体的な詳細、SARS-CoV-2ゲノムの多型の説明、および世界的な広がりに関する最新の情報を提供している。これらの情報は、SARS-CoV-2の差異伝播、高伝播、および病原性を制御する要因についての重要な手がかりを提供する可能性があります。また、2つのSARS-CoV型の間のウイルスタンパク質機能の相対的な違いについても議論してきた。SARS-CoV-2タンパク質は、構造的にも非構造的にも、細胞内の機械を利用する上で重要な役割を果たしており、その知見は、細胞内のシグナル伝達経路を標的にして、宿主の微小環境をウイルスの複製に抵抗力のあるものにするのに役立つ可能性がある。多くのSARS-CoV-2タンパク質は免疫活性化を遅延させ、感染を長期化させ、ウイルスのさらなる複製を可能にする。これに続いて、実質的なIFN産生が行われ、急性組織傷害を助長するサイトカインの嵐が起こる。炎症性のウイルス因子はあまり研究されておらず、さらなる研究が必要である(顕著な質問を参照)。これらのSARS-CoV-2因子の結晶構造の解明は、安全で効果的な抗COVID-19療法またはワクチンの開発に貢献するであろう。以上のことから、SARSコロナウイルスの個々の因子が細胞プログラムの破壊に多様な役割を果たしていることは明らかであり、ここで概説された分野でのさらなる研究の焦点は、ヒトにおける発病と拡散の根本的なメカニズムを解明するのに役立つかもしれず、治療法の探求に役立つであろう。

未解決の質問

HSとより強く相互作用する能力は、SARS-CoV-2の高い感染率に役割を持っているのか?HS は S タンパク質の必須または付属の受容体と考えるべきか?どのようなタイプのHS修飾がウイルスの侵入に不可欠か?ヘパラナーゼを活性化するウイルス性タンパク質は?
ウイルスが異なる地理的な場所に適応するのに役立つ ORF8 と 14 の構造特異的な機能的変化は何か?さらに、これらの遺伝子変異はSARS-CoV-2に対する特異的な免疫療法の設計にどのように利用できるか?

哺乳類のラパマイシン標的複合体(mTORC)1/2複合体は、ウイルスタンパク質の翻訳と免疫の活性化にどのような役割を果たしているのか、また、どのウイルスタンパク質がそれを制御しているのか?

 

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