アルツハイマー型認知症に対するドキシサイクリンの効果 β-アミロイドオリゴマーと神経炎症との戦い

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Doxycycline for Alzheimer’s Disease: Fighting β-Amyloid Oligomers and Neuroinflammation

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6616274/

オンラインで公開2019年7月3日

概要

アルツハイマー病は、最も広く普及している認知症であり、世界中で約4,500万人が罹患している。アルツハイマー病の原因はβ-アミロイドペプチド(アミロイドβ)であると考えられているが、アミロイドβを中心とした治療法が何度も失敗していることから、別の治療法が求められている。考えられることは、アルツハイマー病の神経病理学的シナリオの複雑さは、シングルターゲットの治療法では解決できず、マルチターゲットのアプローチが必要であるということである。

これまでのアルツハイマー病の中核的な標的は、可溶性のアミロイドβオリゴマーと神経炎症であり、これらは密接に有害な関係にある。最も神経毒性の強いアミロイドβオリゴマーは、グリア細胞の活性化を介してシナプスや認知機能の障害を引き起こすと考えられている。

抗炎症薬は、アミロイドβオリゴマーの作用を防ぐことができる。神経炎症は慢性的な事象であり、その状態が続くと炎症性サイトカインが継続的に放出され、神経細胞死や脳の粗大な萎縮が促進されることになる。抗菌作用に加えて、アミロイドーシス、神経炎症、酸化ストレスに対しても多面的に作用するテトラサイクリン系抗生物質は、マルチターゲット治療薬として期待されている。特に、血液脳関門を通過しやすく、安全性の高い第二世代のテトラサイクリンであるドキシサイクリン(Doxy)に焦点を当てる。

ドキシサイクリンは、プリオン病の予防薬として登場し、前臨床試験では、アルツハイマー病のマウスモデルにおいて、アミロイドβオリゴマーや神経炎症に対する効果が確認されている。この結果は、Doxyの治療効果を強く裏付けるものであり、臨床において最大限の効果を発揮するためには、その正確な作用メカニズムを解明する必要がある。

キーワード

アルツハイマー病、βアミロイドオリゴマー、神経炎症、テトラサイクリン、記憶

はじめに

アルツハイマー病は、患者が日常生活を送ることができなくなり、過去や親戚のことを思い出すことができなくなる、微妙で今のところ不治の病である(Selkoe, 2011)。全世界で約4,500万人が罹患しており、社会経済的にも大きな負担となっている。平均寿命が延び、加齢が大きなリスク要因となっているため、さらに増加する可能性がある(Garre-Olmo, 2018)。

アルツハイマー病患者の脳には、細胞外の老人斑と細胞内の神経原線維のもつれという2つの主要な病変が見られる。老人斑は、βアミロイドペプチド(アミロイドβ)の凝集体を豊富に含み、最も神経毒性の高いアミロイドβ可溶性種、すなわちアミロイドβオリゴマー(Aβオリゴマー)の貯蔵庫として、また、神経細胞のジストロフィーや神経細胞ネットワークの遮断の決定因子としての両方の役割を果たす(Mucke and Selkoe, 2012)。神経原線維のもつれには、リン酸化されたタウタンパク質が多く含まれており、タウタンパク質は微小管から解離し、微小管の不安定化を引き起こす。また、ミトコンドリアも損なわれる(Desler er al)。 神経炎症は慢性的な神経毒性を持つ事象であり(Heneka et al 2015)血管壁へのアミロイドβの蓄積により血管系が損傷する(Daulatzai, 2017)。機能レベルでは、シナプス活動が著しく損なわれ、認知障害の発症の原因となる(Mucke and Selkoe, 2012)。神経細胞の損失が進行すると、脳の粗大な萎縮に至る(Pini et al 2016)。

アルツハイマー病のドラマは、認知障害が発生して患者が臨床的に注目されたとき、患者の脳はすでに重度に障害されており、病理は約10~15年にわたって進行しているという事実にある。このことは、有効な治療法を見出すことが非常に難しいことを意味しており、アルツハイマー病の複雑さは、シングルターゲットの治療法をやめて、マルチレベルのアプローチに移行しなければならないことを示唆している。これまでに行われたシングルターゲットの「アミロイドβ中心」の臨床試験はすべて、有意な効果を得ることができなかった(Panza er al 2019)。

本レビューでは、最近、アルツハイマー病と闘う科学者の間で注目されている2つの重要な治療的アルツハイマー病ターゲット、Aβオリゴマーと神経炎症に焦点を当てます。抗Aβオリゴマー、抗炎症活性(Balducci et al 2018)良好な血液脳関門(BBB)伝染性、および安全な薬理学的プロファイルを有する第2世代テトラサイクリン系抗生物質であるドキシサイクリン(Doxy)を用いて、Aβオリゴマーの有害な活動と神経炎症を打ち消す可能性を強調する。

アミロイドβオリゴマー。最も危険なシナプスの敵

アミロイドカスケード仮説は、1992年にHardyとHigginsによって初めて提唱され、次のように述べられた。”老人斑の主成分であるアミロイドβペプチドの沈着が、アルツハイマー病の病因における主要なイベントである」(Hardy and Higgins, 1992)。その約10年後、この理論は大幅に改訂され、アミロイドβ斑はより小さく可溶性のAβオリゴマーに追い越された(Hardy and Selkoe, 2002)。

Aβオリゴマーは、疎水性が顕著でアルツハイマー病脳に過剰に存在するアミロイドβペプチドが凝集し、可溶性オリゴマー、プロトフィブリル、不溶性フィブリルなどの異なるサイズのポリマーが形成されるアミロイド形成過程から生じる最初の種である。

Aβオリゴマーは、小さくて可溶性の凝集体であり、アルツハイマー病の最も強力な毒性を持つコンフォーマーである(Haass and Selkoe, 2007)だけでなく、プラークと比較して疾患の重症度の最も良い相関関係を示す(Kuo et al 1996; Lue et al 1999; McLean et al 1999)。臨床症状が現れる何年も前から検出可能なアミロイドβプラークの数(Perrin et al 2009年)は、患者の認知機能低下の重症度とは相関せず(Lue et al 1999年、Naslund et al 2000年)、アミロイドβ沈着は認知機能が正常な被験者にも見られる。

多くの実験データが、シナプス機能障害におけるAβオリゴマーの重要な役割を支持している。トランスジェニックマウスを用いたADモデルでは、シナプス機能障害や認知機能障害の発症がプラークの沈着に先行していることが明らかになった(Holcomb et al 1998年、Hsia et al 1999年、Mucke et al 2000,Balducci et al 2010b)。ADマウスの脳の超微細構造検査では、プラークが沈着する前にシナプスのコンパートメントにAβオリゴマーが存在することが明らかになった(Balducci et al 2010b)。また、試験管内試験および生体内試験のデータでは、よく特徴づけられた合成Aβオリゴマーを濃縮した溶液や、患者の脳から抽出したオリゴマー種、あるいはアルツハイマー病の変異細胞株から抽出したオリゴマー種を、ナイーブなマウスやラットの脳内に投与すると、新しい樹状突起スパインの形成が阻害され、シナプスの可塑性やリモデリングが阻害され、その結果、学習や記憶が損なわれることが示された(Cleary et al, 2005; Lesne et al 2006; Poling et al 2008; Shankar et al 2008; Balducci et al 2010a; Freir et al 2011)。)

ヒトにおいても、生化学的および形態学的分析から、アルツハイマー病は少なくとも病態の初期段階では、シナプスへの攻撃であることが示されている。実際、認知機能の低下の程度は、海馬領域および関連する皮質におけるシナプス前マーカーであるシナプトフィジンの減少と相関している。特に、MCIや超軽度アルツハイマー病患者の大脳皮質では、年齢をマッチさせた健常者と比較して、シナプトフィジンの発現が25%減少していることが報告されている(Selkoe, 2002)。

仮想シナリオでは、Aβオリゴマーは、新たに形成されたり、プラークを出入りしたりして、多くの機能レベルで中枢神経系を擾乱する、乱れのない動的な実体として視覚化されなければならない(Benilova et al 2012,Forloni et al 2016)。

長年にわたり、シナプスが主なAβオリゴマー標的と考えられてきた。初期の研究では、AβオリゴマーがN-メチルD-アスパラギン酸受容体(NMDAR)などのシナプス後の受容体に干渉する能力を記述することで、これを支持した(Balducci et al, 2010b; Yamin, 2009)カルシウム電流に影響を与え、α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid受容体(AMPARs)にも影響を与え、最終的な結果として、シナプス可塑性の阻害や、新しい記憶が保存される樹状突起棘の新規形成の阻止/廃絶による記憶障害の誘発が起こる(Chidambaram er al)。 また、ニコチン性アセチルコリン受容体α7-nAcChRとの相互作用を介して、シナプス前区画での作用も記載されている(Dineley et al 2001,Puzzo et al 2008)。細胞性プリオンタンパク質(PrPC)がAβオリゴマーの作用を媒介することが示唆されているが、我々や他の研究者は、PrPCとAβオリゴマーとの直接的な結合を確認しているが、機能的な寄与は確認していないので、この点については議論の余地がある(Forloni and Balducci, 2011)。また、アポトーシス機構の活性化も、Aβオリゴマーを介したシナプス消失のメカニズムの一つとされている(Jo et al 2011)。

しかし、近年になって、Aβオリゴマーとグリア細胞との密接な相互作用がシナプスの障害や消失に関与しているという説得力のある新説が登場している。

神経炎症 気をつけたいもう一つの特別な原因

神経炎症は、神経変性の原動力として再登場した(McManus and Heneka, 2017)。ミクログリアは、脳組織の恒常性維持に重要で、向神経性因子を分泌し、特に感染や細胞傷害後にアストロサイトやニューロンに影響を与えるサイトカインやケモカインを放出して微小環境をパトロールしている。これにより、通常は一過性の免疫反応を呼ぶ炎症事象が誘発され、その後、組織が修復される。病的な状態では、修復がうまくいかず(Serhan et al 2007,Serhan 2010年)慢性的な神経炎症と神経変性が促進される。

ミクログリアは、アルツハイマー病では老人斑の周囲で慢性的に活性化した状態にあり、炎症性サイトカインを継続的に放出することで、疾患のごく初期段階から神経病理を促進する(Heneka er al)。 アルツハイマー病の脳における神経炎症は慢性的であり、それはおそらく、特殊な解決促進メディエーターのレベルが低いことを示す研究が示すように、決して解決されないからである(Wang et al 2015)。

Aβオリゴマーの有害な作用とミクログリア細胞との関係は、ミクログリアがシナプスのモデリングや活動、ひいては認知機能の制御にも重要な役割を果たしているという事実によって示されている。静止状態のミクログリアは、神経細胞と密接に接触することで、神経細胞の活動を調査する。ミクログリアは、非常にダイナミックで可塑的な細胞であり、活動や経験に依存して絶えず突起を伸ばしたり引っ込めたりしてシナプスに接触する(Morris er al)。 しかし、アルツハイマー病のようにミクログリア細胞の活性化が慢性化した病態下では、シナプスのモニタリング機能が失われ、認知機能が阻害される。

Aβオリゴマーとミクログリア細胞の間には「危険な連絡係」が存在し、シナプスへの有害な影響を相互に持続させていることが、多くのデータから裏付けられている。Aβオリゴマーとアミロイドβフィブリルの効果を比較した一連の研究によると、Aβオリゴマーはミクログリアの活性化をより大きく促進し、明らかに構造に依存していることが明らかになった(Heurtaux et al 2010),最も軽いオリゴマー種が神経炎症を引き起こしやすい。Michelucci et al 2009)は、Aβオリゴマーがフィブリルよりも強くM1ミクログリアの炎症表現型を誘導することを報告している。He et al 2012)は、AβオリゴマーをC57BL/6マウスの海馬に慢性的に投与すると、より顕著な炎症作用が見られ、それがより深刻な認知障害、神経組織の変化、超微細構造の変化と密接に関連していることを示した。また、Aβオリゴマーがtoll-like receptor-4(TLR4)やTNF-αの発現を増加させることも明らかにした。

TLR4は、自然免疫応答を開始するパターン認識受容体としてよく知られているファミリーに属しており、アルツハイマー病に決定的に関与している(Drouin-Ouellet and Cicchetti, 2012)。我々は、Aβオリゴマー誘発性急性マウスモデルを用いて、C57BL/6のナイーブマウスにAβオリゴマーを単回脳内注射(ICV)することで、新規物体認識テストにおける一過性の記憶障害を誘発することも示した(Balducci et al, 2010a)長期記憶の精緻化、定着に重要な区間である2-24時間の時間枠内で、海馬におけるグリア細胞の一過性の活性化と炎症性サイトカインの発現増加に関連している(Balducci er al)。 抗炎症薬による前処理は、Aβオリゴマーを介した記憶障害を消失させた。Aβオリゴマーとミクログリアの活性化が記憶障害につながる分子メカニズムについてさらなる洞察を求める一方で、AβオリゴマーをICVで投与したTLR4欠損マウスでは記憶障害もグリアの活性化も観察されなかったことから、TLR4が不可欠であることも確認した(Balducci er al)。

シナプス機能障害と認知障害のほかに、ミクログリアの活性化もシナプス消失を説明するために登場する。(Hong et al 2016)は、非常にエレガントな論文で、ミクログリアがC1qとC3補体因子を介してシナプスの異常な取り込みを媒介することを示した。C1qは古典的補体経路の開始タンパク質であり、C3とともにシナプス上に局在し、ミクログリアの食作用を介してシナプスの刈り込みを媒介する(Presumey er al)。 アルツハイマー病のような病的な状態では、その発現が増加し、シナプス後のタンパク質に局在し、シナプスの消失を悪化させる。この現象がアルツハイマー病変異マウスの非常に早いプラーク前の年齢で検出されたことから、可溶性のアミロイドβ種が関与している可能性が高いことが示唆された。このことは、野生型マウスにAβオリゴマーをICVで特異的に注射することで確認され、C1qシナプス沈着の増加と、C1qを介したC3オプソニン化がシナプスをマーキングして除去することが示された(Hong et al 2016)。

アルツハイマー病の治療にテトラサイクリンを。抗生物質だけではない

アルツハイマー病の最も困難な課題の1つは、発症を遅らせ、進行を止め、認知機能障害を予防または回復させるための有効な治療法を特定することである。現在まで、ほとんどの試みはアミロイドβペプチドに焦点を当てており、有益な効果はほとんどない(Panza er al 2019)。これらの複数の失敗を説明する理由はいくつかあるかもしれない:間違った治療のタイミング、不適切な治療レジメン、患者の選択が悪いか不十分であること。これらはすべて有効な可能性であるが、治療の成功を制限する主な問題の1つは、おそらくマルチターゲット治療を必要とするアルツハイマー病の多因子性の性質にあるかもしれない。

そこで私たちは、マルチターゲット治療法として抗生物質テトラサイクリンを提案する。特に、第二世代のテトラサイクリンであるドキシは、より安全な薬理作用を持ち、BBBの通過性も良好である。

2000年代初頭、テトラサイクリン系薬剤が、ヒトの合成PrPの106-126残基および82-146残基とアミロイドβペプチドの両方の凝集を阻害することが無細胞培養法により明らかになり、アルツハイマー病に対するテトラサイクリン系薬剤の関心が高まった。また、PrPやアミロイドβの凝集が促進されることや、それらの凝集体がプロテアーゼに対して感受性を持つことも報告されている(Tagliavini et al 2000,Forloni et al 2001)。このような抗アミロイド作用は、後にハンチントン病やパーキンソン病などの神経変性疾患の原因となる他の一連のミスフォールディングタンパク質でも確認された(Stoilova er al)。でレビュー)。

テトラサイクリン類の神経保護活性は、まずPrPに対して試験管内試験で実証され、さらに生体内試験では合成PrP残基82-146および106-126を用いて、また病的な形態のPrP、すなわちPrPスクレイピー(PrPsc)の感染を通して実証された。In vitroでは、テトラサイクリンは、PrP 106-126が媒介する神経毒性およびアストログリア増殖を防止した(Tagliavini et al 2000)。実験的スクレイピーにおいて、生体内試験でテトラサイクリンまたはDoxyのいずれかを前処理すると、感染性が低下し、病理学的発症が遅延し、シリアン・ハムスターに脳内注射した場合の生存率が増加した(De Luigi et al 2008)。263KのPrPsc感染脳ホモジネートを1mMのテトラサイクリンまたはドキシサイクリンとインキュベートすると、PrPscのPK耐性コアが80%以上減少した。また、これらの化合物は、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)の新しい変種の患者から得られた部分的に精製されたPrPscと相互作用することが報告されている(Forloni et al 2002)。

臨床レベルでは、ドキシはCJD患者を対象とした初期の観察研究で肯定的な結果を示したが、確定的または確率的な散発性CJDまたは遺伝的形態の診断を受けた被験者を対象とした、プラセボに対する二重盲検試験では確認されなかった(Haik er al 2014)。その後、ドキシを4年間投与した無症候性CJD患者がより長く生存したことが報告され(Assar et al 2015,Pocchiari and Ladogana 2015 Varges et al 2017)は早期CJD患者でより長い生存期間を示し、本剤の予防的作用を示唆している。

アルツハイマー病では、ドキシは軽度から中等度の患者を対象とした2つの臨床試験で、肯定的な結果と否定的な結果の両方が得られている(Loeb et al 2004,Molloy et al 2013)。1つ目の試験では、認知能力や機能的行動の低下が少なかったのに対し、2つ目の試験では効果が得られなかった。この2つの試験は、登録時の患者の病期が同じであった。最初の試験では、ドキシは200mg/日の用量で、リファンピン300mg/日と一緒に経口投与された。2回目の試験でも同じ用量で投与されたが、唯一の違いはドキシを1回ではなく、100mgを1日2回投与したことである。主な違いは、前者では患者の治療期間が3カ月であったのに対し、後者では治療期間が12カ月であったことである。著者らが述べているように、後者の研究が失敗した理由の一つは、Doxyには3ヶ月以上の治療で明らかになる何らかの負の特性があるのではないかということである。残念ながら、治療効果は行動レベルと機能レベルでしか検討されておらず、血漿および/または脳脊髄液中のアミロイドβおよびタウレベル、あるいは炎症状態の評価は行われていない。

このような臨床レベルでの論争にもかかわらず、前臨床研究ではDoxyの治療効果の可能性が示された。最初の研究は、2つの単純な生体内試験モデルで行われた。Diomede et al 2010)は、アルツハイマー病の単純化された無脊椎動物モデルである線虫(Caenorhabditis elegans)を用いて、細胞内のアミロイドβ沈着が線虫の麻痺を引き起こす場合に、Doxyを試験した。ドキシは、アミロイドβの凝集体と直接相互作用し、Aβオリゴマーの負荷を軽減することで、この障害から保護した。その後、Costa et al 2011)は、アミロイドβ42を発現させたショウジョウバエにドキシを投与しても寿命は改善しないが、運動障害の進行を遅らせ、発達期の眼におけるアミロイドβの毒性を部分的に回復させることを明らかにした。

我々は最近、Doxyがアルツハイマー病の急性および慢性モデルマウスにおいて有益な効果を持つことを発見した(Balducci er al 2018)。APP/PS1dE9トランスジェニックマウスに10mg/kgのDoxyを20日間または2カ月間腹腔内注射する慢性治療を行ったところ、プラークの減少とは無関係に記憶力が有意に回復したが、18merオリゴマー種の発現が低下した。興味深いことに、急性期の治療でも記憶の回復が見られた。これらの証拠と、プラーク数の変化がなかったことから、我々は、ドキシがオリゴマー種に干渉することで記憶を回復させていると考えた。このことは、前述のAβオリゴマー誘発急性マウスモデルで確認され(Balducci et al 2010a; Balducci and Forloni, 2014)C57BL/6のナイーブマウスにAβオリゴマーを特異的にICV投与し、Doxyで前処理したマウスは、認識記憶の障害がなくなっていることが実証された。さらに、ミクログリアの活性化とAβオリゴマーの有害な認知効果との間には密接な関係があることから(He et al 2012; Balducci et al 2017)記憶保護はAβオリゴマーを介したミクログリアの活性化の廃止と関連していることをさらに示した。また、Doxyの抗炎症作用が記憶の回復とともにあることは、Doxyを慢性的に投与したAPP/PS1dE9マウスや、Aβオリゴマーに依存しない炎症の状況を呈するLPS投与マウスでも証明された(Balducci er al 2018)。ドキシの抗炎症効果は、一連の他の病理学的文脈で実証されている(Stoilova et al 2013にレビュー)。図1は、我々のADマウスモデルで上述したすべてのDoxy効果を描いている。

図1 ADモデルマウスにおけるドキシを介した効果

アルツハイマー病の脳内では、Aβオリゴマーが最も強力な毒性種であり、記憶障害の原因となっている。このような有害な作用は、認知機能障害、シナプスの消失、神経変性の両方を引き起こすアルツハイマー病の慢性的な事象であるミクログリア細胞の活性化と関連している。ドキシは、Aβオリゴマーの作用を直接中和して神経細胞やグリア細胞に作用させたり、直接抗炎症作用を発揮したりして、Aβオリゴマーの作用を阻害する。これらの作用は、記憶を正常に戻すという認知レベルでのポジティブな結果につながっている。


Aβオリゴマー-Doxyの直接的な結合は見られなかったが、Aβオリゴマーとテトラサイクリンの場合と同様に、非典型的な超分子相互作用が起こり、その結果、コロイド構造が形成されてAβオリゴマーの毒性を封じ込めたり、消失させたりするのではないかと推測している(Airoldi et al 2011)。これを受けて、Costa et al 2011)は、伝染型電子顕微鏡、動的光散乱、チオフラビンT結合を用いて、Doxyがより小さく、非アミロイドで毒性のないアミロイドβ凝集体の形成をもたらすことを実証した。図2は、アルツハイマー病患者の脳内で予想されるDoxyを介した変化をまとめたものである。

図2 アルツハイマー病の脳におけるDoxyの複数の有益な作用

(A)は、ドキシを投与する前のアルツハイマー病脳。大きさの異なるアミロイドβプラークが広く沈着し、それを活性化したミクログリア細胞が取り囲んでいる。Aβオリゴマーはプラークに近いところや遠いところを自由に行き来しており、神経炎症と相まって記憶障害を引き起こしている。(B)ドキシ投与されたアルツハイマー病の脳。ドキシの有益な効果がまとめられている。長期投与によりプラーク量が減少する。Aβオリゴマーはドキシと相互作用し、おそらく非アミロイド原性かつ非毒性の構造体を生成し、ミクログリア細胞は休息状態に近づく。Aβオリゴマー負荷の減少とミクログリアの活性化の両方が、ドキシを介した記憶回復の原因と考えられる。


テトラサイクリンは、抗アミロイド原性および抗炎症作用のほかに、抗酸化作用および抗アポトーシス作用も有している(Stoilova er al 2013; Santa-Cecília er al 2019)。酸化ストレスとアポトーシスは、アルツハイマー病の典型的な特徴であり、複雑な病理学的シナリオにおいてその解決は、脳の生理学をよりよく回復させるのに役立つ。

このような証拠と、トランスレーショナル・プロスペクトにおけるドキシの良好な薬理学的特徴は、この薬剤がアルツハイマー病やその他の神経変性疾患に対してかなりの治療の可能性を秘めていることを示唆している。最近発表された包括的なレビューでは、パーキンソン病や多発性硬化症においても、ドキシの保護効果がよく説明されている(Santa-Cecília er al 2019)。

ドキシの有益な効果にもかかわらず、臨床試験では、すべての治療プロトコルが有効であるわけではなく、また患者の登録に適した病期でもないことがわかっている。あまりにも病状が進行した患者は、明らかに反応しそうにない(Assar et al 2015,Pocchiari and Ladogana 2015)。このことは、必ずしも薬が効かないことを意味するものではなく、より適切に使用しなければならないことを意味している。このような理由から、ドキシはアルツハイマー病治療においてもう一度チャンスを得る価値がある。より可能性が高いのは、前駆症状の段階での適用と「精密医療」アプローチである。後者は、非反応者と比較して反応者の臨床プロファイル(すなわち、炎症プロファイル)を定義することができるため、強く推奨される。

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