Developing natural products as potential anti-biofilm agents

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6425673/

要旨

バイオフィルムは、環境のニッチに遍在的に存在する細菌増殖の自然な形態である。バイオフィルムの形成は、抗生物質や抗菌剤に対する抵抗性を含む環境の負の影響に対する抵抗性を高める結果となる。クオラムセンシング（QS）は細胞間のコミュニケーション機構であり、バイオフィルムの形成に重要な役割を果たし、細菌密度が高くなると環境のバランスを整える。バイオフィルムは感染症や多剤耐性菌の蔓延の原因となることから、バイオフィルムの形成・発達を制御する新規抗菌薬の開発が急務となっている。

植物由来の天然物がバイオフィルム形成の調節に抗菌・化学予防効果を有することは、過去20年の間に実証されてきた。本レビューでは、明確なメカニズムや分子アドレスが同定されている植物からの天然の抗バイオフィルム剤の発見に関する最近の研究と、メカニズムが不明なハーブや生理活性成分が同定されていないハーブの発見に関する研究を要約する。

また、天然の抗バイオフィルム物質の抽出・同定技術の進歩にも注目する。また、臨床試験中の抗バイオフィルム治療薬についても議論する。これらの新たに発見された天然の抗バイオフィルム剤は、バイオフィルム関連感染症の新たな治療法を提供する可能性のある有望な候補である。

キーワード

抗バイオフィルム剤、天然物、クオラムセンシング阻害、バイオフィルム関連感染症

序論

何十億年にもわたる選択的圧力により、バクテリアの生存戦略は数多く生まれてきており、この生物はほとんどあらゆる環境ニッチに適応している。細菌にとって好ましい増殖状態の一つは、90%以上の細菌に存在するバイオフィルムとして知られている。バイオフィルムは、細胞外マトリックス（細胞外マトリックス）に埋め込まれた細菌の多細胞性表面付着群集である。

バイオフィルムの形成には、細胞間コミュニケーションであるクオラムセンシング（Quorum sensing）が重要な役割を果たしていることが明らかになっている。バイオフィルム内に生息する細菌は、抗生物質やその他の殺菌剤に対する適応的な耐性を、プランクトン性コンパートメントと比較して非常に高いパターンで示している。

世界的に増加している適応性抗生物質耐性は、院内肺炎症例、外科的創傷感染症、カテーテル感染症、熱傷感染症、人工呼吸器関連肺炎などのバイオフィルム関連の急性および慢性感染症[1-3]を治療する際の障害となっている。このようにバイオフィルム形成は、医療や食品産業などの分野で多くの問題を引き起こしている[4]。

一方で，抗生物質の誤用は薬剤耐性の開発にも寄与しており，感染症を悪化させる可能性がある．このように，細菌やバイオフィルムの形成に対抗するためには，抗生物質以外の新たな戦略が必要である。

過去20年の間に、植物由来の天然物を含むバイオフィルム形成やクオラムセンシングを防止するための新規なアプローチが広く開発され、報告されてきた。多くの植物天然物は、抗菌性および化学的予防特性が実証されている[5]。漢方薬が何世紀にもわたって様々な人類文化によって採用されてきたことはよく知られており、それらの天然物の中には感染症の予防や治療に不可欠なものもある。

例えば、中国の伝統的な薬草は細菌感染症や予防によく使われており、タツナミソウ、たんぽぽ、フキタンポポなどの一部のハーブは抗菌力を示していた[6]。最近では、植物の抽出物がバイオフィルムの形成を調節し、クオラムセンシングを抑制することも報告されている[7]。世界には数千種類の薬草が存在し、特に中国では伝統的な薬草が感染症治療に長い歴史を持っていることから、薬草は豊富な情報源であり、バイオフィルム対策のための新製品の抽出にはより有望であると考えられる。

 

本研究では、バイオフィルム形成のメカニズムとクオラムセンシング、植物由来の天然物のバイオフィルム防止剤としての発見と同定、および潜在的な成分の同定のための抽出アプローチの最近の進歩について簡単にまとめた。また、植物由来の抗バイオフィルム治療薬に関連する臨床試験もリストアップされ、議論された。これらの新たに発見された天然の抗バイオフィルム剤は、病原性細菌との闘いやバイオフィルム関連感染症の治療に新たな戦略を提供しうる有望な候補である。

バイオフィルムの発生とクオラムセンシングとの関係

バイオフィルムの形成は、細菌が多剤耐性を発症する主要な原因の一つと定義されている。バイオフィルムのライフサイクルは、細菌の初期付着、微生物コロニー形成、細菌の増殖、細胞外マトリックス生成の4つのステージからなり、バイオフィルムは最新のステージとして成熟し、その後、新たなニッチを求めて細菌が分散していく（図1）。

基質表面には、エキソ多糖類、タンパク質、核酸などを主成分とする宿主ポリマーマトリックスが存在し、細菌の不可逆的な付着を促進している。スタフィロコッカス・エピダーミディスの付着開始には、Aap や SasG などの細胞表面関連タンパク質が関与していることが報告されており、Aap タンパク質には G5 ドメインが含まれており、細菌の細胞間接着に関与していることが報告されている[8]。

表面露出タンパク質、細胞外グルカン結合タンパク質、糖転移酵素（GtfE、GtfG、GtfH）などの細胞外成分も細胞接着能力に重要な役割を果たしている[9]。また、細胞表面タンパク質を固定するトランスペプチダーゼであるソルターゼA（SrtA）は、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌の感染時に細胞外局在化やバイオフィルム形成を誘発する[10]。そのため、これらの粘着性タンパク質に対する阻害剤が広く開発され、良好な抗バイオフィルム活性や抗微生物活性を増強する可能性があると考えられている。その後、粘着性細菌はマイクロコロニーへと増殖した。バイオフィルム形成が成熟すると、栄養分の流入と老廃物の排出のための水の流路を持つ複雑なマトリックス構造が形成されるようになった[11]。

細胞外マトリックスの構成要素には、DNA、タンパク質、炭水化物などが含まれている。例えば、TapA、繊維状タンパク質TasA、エキソ多糖類は枯草菌のバイオフィルム形成に重要な成分であり、これらのマトリックス成分の発現を活性化するためにはスペルミジンも必須であった[12]。バイオフィルム内の酸素濃度やpH値などの条件が異なると、遺伝子発現プロファイルが異なることが示唆された [13]。バイオフィルム内の酸素濃度が低下すると、プログラムされた細胞溶解（PCL）が増加し、S. aureus のバイオフィルム形成が促進される可能性があった [14]。このバイオフィルム形成の促進は、SrrABとSaeRSに依存したAtlAムレインヒドロラーゼのアップレギュレーションと細胞質DNAの放出によるものである[15]。また、バイオフィルム形成に関するゲノムワイド解析の研究では、ClpYQプロテアーゼやプリン生合成の遺伝子など、バイオフィルム形成に関連する遺伝子を発見した研究もある[16]。バイオフィルムが成熟した後、細菌はバイオフィルムから脱出し、新たな付着を開始することができ、新たなバイオフィルムのライフサイクルに貢献している。

図1　バイオフィルム形成とクオラムセンシング　4つのステップ

この図は、バイオフィルムのライフサイクルの4つのステップと、バイオフィルム形成と定足数センシングに関与する関連因子を示している。

• バイオフィルムは細菌の初期付着から始まり、その後不可逆的な付着へと発展する。この2つの期間中、細胞外DNA、プロテアーゼ、細胞表面タンパク質またはバイオフィルム関連タンパク質がバイオフィルムの開始に関与している。
• 次の段階では、細胞外マトリックスが生成され、バイオフィルムが成熟する。バイオフィルム形成の最後の2段階では、クオラムセンシング（QS）と呼ばれる細胞間コミュニケーション機構が重要な役割を果たしている。複数のオートインデューサーとそれに対応する転写受容体が様々な病原性因子の産生を調節しており、バイオフィルムの制御と環境平衡に貢献している。
• 最後に、細菌はバイオフィルムから分散して新たなニッチを見つけ、新たなバイオフィルム形成を開始し、その結果、バイオフィルムのライフサイクルが完了する。

抗バイオフィルム形成に関する戦略は、主にバイオフィルム形成の各段階を対象としており、接着マトリックスと微生物の付着の阻害、細胞外マトリックスの生成の阻害、クオラムセンシングシグナル伝達の妨害などが含まれる。

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細胞間コミュニケーション機構であるクオラムセンシング（QS）は、グラム陰性種と陽性種の両方でバイオフィルム形成に重要な役割を果たしていることが明らかになっている。バイオフィルム形成におけるクオラムセンシングの役割の根底にあるメカニズムは、広く研究されてきた。

クオラムセンシングは、細菌が集団から分泌される特定の自己産生シグナル分子の蓄積を感知して測定することで、集団密度を認識することを可能にする[17, 18]。一方、それは細菌の遺伝子発現を変化させ、環境中に蓄積されたシグナルのレベルを誘導するために十分に高い集団密度があるときにシグナル伝達経路を活性化することで協調応答を活性化する[19]。これらの遺伝子は、外酵素、プロテアーゼ、エラスターゼ、ピロシアニンなどの病原性因子のアーセナルをコードしている。クオラムセンシングに関与する分子機構は広く研究されてきたが、グラム陽性菌とグラム陰性菌では異なることが明らかにされており、その詳細がまとめられている[20-22]。

グラム陽性菌は環境中で自己誘導性ペプチド（AIP）を分泌していた。AIPは、細菌膜上のキナーゼ受容体と結合して対応する転写因子にシグナルを伝達し、最終的には付属遺伝子調節因子（Agr）やRNAIIIなどの関連遺伝子の発現を活性化する。Agr系は、グラム陽性菌における最も古典的なクオラムセンシング系として同定された（図2）。グラム陽性菌の中で最も一般的な細菌であるS. aureusのAgr系は、毒素（フェノール可溶性モジュリンPSM、α毒素、デルタ毒素（hld）など）や分解性外酵素（プロテアーゼSspA、SspB、Splなど）を含む病原性因子の産生に重要な役割を果たしていることがよく研究されていた[21]。一方、グラム陰性菌のコミュニケーションでは、オートインデューサーであるアシルホモセリンラクトン（AHLs）が一般的に産生され、細菌群集中のAHLsオートインデューサーの濃度が高くなると、細胞質受容体と結合して標的遺伝子の発現を調節することが知られている。

グラム陰性菌のクオラムセンシングシステムはLUXL/LUXR転写因子であり、AHLsによって活性化され、ピロシアニン、レクチン、エラスターゼ、プロテアーゼ、毒素などの病原性因子の産生に影響を与えている（図3）。また、他の種類のオートインデューサー（Pseudomonas quinolone signal（PQS)CAI-1,AI-2など）や関連するgens/クオラムセンシング受容体（LasI/LasR、RhlI/RhlR、CqsS、LuxPQなど）は、グラム陰性菌の種類によって様々であった[20]。さらに、クオラムセンシングはバイオフィルムの構造に影響を与え、宿主免疫や抗生物質治療などの外部要因からの固有の保護を提供することが示されている[4]。

バイオフィルムのライフサイクルを、プロセスの主な参加者とともに図1に示す。グラム陽性菌とグラム陰性菌のクオラムセンシング調節系を図2に、グラム陰性菌のクオラムセンシング調節系を図3にそれぞれ示す。バイオフィルムの複雑な状態と細胞間のコミュニケーション機構を積極的に研究することは、クオラムセンシング阻害剤（クオラムセンシングI）やバイオフィルム関連感染症に対する新規治療薬を同定するための新しい戦略とターゲットを科学者に提供する。

図2　グラム陽性菌における正統的なクオラムセンシングシグナル伝達とバイオフィルム形成における役割

 

グラム陽性菌における最も古典的なクオラムセンシング系としてAgr系が同定された。グラム陽性細菌の中で最も一般的な細菌であるS. aureusにおけるAgr系は、毒素やプロテアーゼを含む病原性因子の産生に重要かつ責任を持つことがよく調べられた。Agr系は、AgrA、AgrB、AgrC、AgrDの4つの要素を含むAgrオペロンによって制御されている。AgrDは、グラム陽性細菌における特異的なオートインデューサーであるオートインデューサーペプチド（AIPs）の前駆体であった。AgrDはAgrBによって修飾され、細胞外マトリックスに分泌される。細菌密度が高くなると、AIPsは膜貫通タンパク質AgrCを活性化する。

リン酸化されたAgrCはさらにAgrAを活性化し、最終的に目的遺伝子の発現を促進する。AgrAによって制御されるプロモーターは2つある。一つはAgrタンパク質を調節するP2であり、もう一つはRNAIIIの発現を活性化できるP3である。RNAIIIは、クオラムセンシング関連因子やバイオフィルム形成に関連するタンパク質の発現を調節する重要な調節因子である。RNAIIIは、プロテアーゼ、毒素、分解酵素などの病原性因子の発現のアップレギュレーションを誘導することができる。一方、RNAIIIは細胞接着性タンパク質や表面タンパク質の発現を抑制し、細菌の分散に寄与する可能性がある。このような二重の機能を持つAgrシステムは、細菌の群集と感染のバランスをとることができるかもしれない。このことは、Agr系、Agr系、RNAIIIを標的とした抗バイオフィルム剤を開発するための治療標的を提供することにもつながると考えられる。

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図3　グラム陰性菌におけるクオラムセンシングシグナル伝達とバイオフィルム形成におけるその役割

 

グラム陰性菌のコミュニケーションでは、自己誘導性アシルホモセリンラクトン（AHL）が一般的に産生され、対応する細胞質受容体を活性化して標的遺伝子の発現を調節していた。グラム陰性菌におけるクオラムセンシングシステムの標準的なキー・レギュレーターはLUXL/LUXR転写因子であり、AHLsによって活性化され、ピロシアニン、レクチン、エラスターゼ、プロテアーゼ、毒素などの病原性因子の発現を含む標的遺伝子の発現を促進することができた。

他にも、グラム陰性菌の種類によって異なるオートインデューサー（Pseudomonas quinolone signal（PQS)CAI-1,AI-2など）とそれに対応するクオラムセンシング受容体（LasI/LasR、RhlI/RhlR、CqsS、LuxPQなど）が存在する。特定のオートインデューサーによって活性化された受容体は、最終的に接着剤や病原性因子などの遺伝子発現を促進し、バイオフィルムの形成にさらに関与している。

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明確なメカニズムまたは同定された分子アドレスを有する天然の抗バイオフィルム剤

植物由来の天然物の多くは、試験管内試験で抗菌・抗バイオフィルム機能を有していた。その結果、天然植物や薬草抽出物に由来する様々な分子と、その抗バイオフィルム機能の基礎となるメカニズムが明らかになった。天然物の抗バイオフィルム効果は、主に、ポリマーマトリックスの形成抑制、細胞の接着・付着の抑制、細胞外マトリックスの生成抑制、病原性因子の産生の抑制、それによってクオラムセンシングネットワークやバイオフィルムの形成を阻害することに依存している。

以下では、ニンニク、Cocculus trilobus、Coptis chinensisなどの薬用植物から抽出されたこれらの抗バイオフィルム剤をまとめ、議論し、表1に示した。また、これらの天然物または植物抽出物の抗バイオフィルム効果に関連する基礎的なメカニズムを図4に示した。

表1 抗バイオフィルム効果における天然の抗バイオフィルム剤とその分子機構

植物抽出物/化合物	メカニズム/分子アドレス	対象菌	抗バイオフィルム効果	参考文献
N-（ヘプチルスルファニルアセチル）-1-ホモセリンラクトン（ニンニク抽出物）	転写調節因子LuxRおよびLasR	緑膿菌	病原性因子の精緻化の減少とクオラムセンシングシグナルの生成の減少	[ 23 – 25 ]
Cocculustrilobusの酢酸エチル画分	ソルターゼ	グラム陽性菌	バイオフィルム形成の接着段階での抗アドヘシン効果の発揮	[ 26 ]
ポリフェノール（クランベリー）	グルカン結合タンパク質、バイオフィルム形成に関与する酵素	齲蝕原性および歯周病原性細菌	細胞外マトリックスの破壊、炭水化物の生成、細菌の疎水性、タンパク質分解活性、およびバイオフィルム形成に関与する凝集に影響を与える	[ 27 – 31 ]
パトリニアエ	バイオフィルム関連遺伝子	緑膿菌	バイオフィルム形成の阻害とエキソポリサッカライド産生の減少	[ 32 ]
ギンコリン酸	カーリ遺伝子とプロファージ遺伝子	大腸菌O157：H7	ガラス、ポリスチレン、ナイロン膜の表面でのバイオフィルム形成の抑制	[ 33、34 ]
シンナムアルデヒド	LuxRのDNA結合能力	大腸菌およびビブリオ属。	影響を受けるバイオフィルムの形成と構造、水泳の運動性、ストレス応答、病原性	[ 35、36 ]
フロレチン	大腸菌O157：H7の毒素遺伝子（hlyEおよびstx（2））、autoinducer-2インポーター遺伝子（lsrACDBF）、curli遺伝子（csgAおよびcsgB）、およびプロファージ遺伝子	大腸菌O157：H7	バイオフィルム形成と線毛生成の減少	[ 37 ]
フロレチン	排出タンパク質遺伝子	黄色ブドウ球菌RN4220およびSA1199B	低濃度（1〜256μg / ml）での抗バイオフィルム形成	[ 38 ]
イソリモン酸	luxOおよびAI-3 /エピネフリン活性化細胞間シグナル伝達経路	ビブリオharveyi	細胞間シグナル伝達とバイオフィルム形成を妨げる	[ 39、40 ]
ホルデニン	クオラムセンシング関連遺伝子	緑膿菌	バイオフィルム形成や病原性因子の低下など、クオラムセンシング制御の表現型をブロック	[ 41、42 ]
ケルセチン	SrtA	肺炎連鎖球菌	SrtAの機能がブロックされ、シアル酸の生成に影響を与え、バイオフィルムの形成を損なう	[ 49 ]
ケルセチン	LasI、LasR、RhlIおよびRhlR	緑膿菌	阻害されたバイオフィルム形成および病原性因子の産生	[ 44 – 48 ]
ケルセチン	pH	S.ミュータンス	バイオフィルムのpHを乱した	[ 50 ]
ケルセチン	解糖系、タンパク質翻訳-伸長およびタンパク質フォールディング経路	エンテロコッカスフェカーリス	ブロックされた解糖、タンパク質翻訳-伸長およびタンパク質フォールディング経路	[ 51 ]
Z ingiberofficinaleのメタノール画分	病原性遺伝子、F-ATPase活性、表面タンパク質抗原SpaP	S.ミュータンス	表面タンパク質抗原SPAPとの細胞表面の疎水性指数に対する阻害効果の阻害S.ミュータンス	[ 53 ]
エタノール抽出物のP. betleの葉（PbLE）	ピオシアニン	緑膿菌PAO1株	PbLE抽出物によるピオシアニン産生の阻害および細菌の群れ、水泳、およびけいれん能力の低下	[ 54 ]
ベルゲニアクラシフォリア（L.）葉抽出物	Gtfs、EPS	S.ミュータンス	GtfsがEPSを合成するのを阻害することにより、S。mutansの付着特性を低下させました	[ 55 ]
Rhodomyrtustomentosaからのエタノール抽出物	調査されていない	黄色ブドウ球菌、Staphylococcus epidermidis	ブドウ球菌のバイオフィルム形成を阻害し、成熟したバイオフィルムを殺した	[ 56 ]
Hymenocallislittoralisの葉の抽出物	アドヘシンタンパク質、SrtAおよびAls3	黄色ブドウ球菌NCIM2654およびカンジダアルビカンスNCIM3466	抗菌、抗バイオフィルム形成および抗酸化活性	[ 57 ]
Camellia sinesisからのポリフェノール抽出物（エピガロカテキン-3-ガレート）	調査されていない	嚢胞性線維症（CF）から分離されたステノトロホモナスマルトフィリア（sm）	invitroでのバイオフィルムにおける細菌細胞の生存率の低下および野生型およびCFマウスの急性感染モデルにおけるSm細菌数の有意な低下	[ 58 ]
Rosarugose茶からのポリフェノール抽出物	クオラムセンシング制御のビオラセイン因子	Chromobacterium v​​iolaceum 026 、E。coliK -12およびP.aeruginosa PAO1	抑制された群れの運動性とバイオフィルム形成	[ 59 ]
エリアニン	SrtA	黄色ブドウ球菌	ダウンレギュレートされたSrtA、それにより細胞接着を阻害	[ 60 ]
イソビテキシン	スパ	USA300	SpAを減らし、バイオフィルム形成を抑制しました	[ 61 ]
パルテノリド	LasI、RhlI、LasR、RhlR、および細胞外高分子物質	緑膿菌PAO1	LasI / LasRおよびRhlI / RhlRを含む抑制されたクオラムセンシング関連遺伝子発現およびダウンレギュレートされた細胞外高分子物質	[ 62 ]
ローマンカモミールの花の抽出物	調査されていない	緑膿菌PAO1および患者から分離された菌株	バクテリアの群れとバイオフィルム形成の抑制	[ 76 ]
ふすま	AHL	黄色ブドウ球菌	AHLレベルのダウンレギュレーションによるクオラムセンシングおよびバイオフィルム形成の阻害	[ 77 ]

クオラムセンシング, quorum sensing; SrtA, sortase A; SpA, Staphylococcal protein A; AHL, autoinducer acylhomoserine lactones

図4　天然植物由来の抗バイオフィルム剤とその潜在的なメカニズム

 

バイオフィルム形成の阻害は、主に微生物の付着・付着の抑制、ポリマーマトリックスや細胞外マトリックスの生成の阻害、細菌の凝集やクオラムセンシングネットワークへの干渉などのサーバルな側面に起因する。クオラムセンシング, quorum sensing; SrtA, sortase A; SpA, Staphylococcal protein A; 細胞外マトリックス, extracellular matrix; AIP, autoinducer peptide; AHL, autoinducer acylhomoserine lactone

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ガーリック

ニンニクは抗菌作用を持つ多くの化合物が豊富に含まれていると考えられている。ニンニク抽出物によるクオラムセンシングに対する阻害効果が示されている。これに関して、Bjarnsholtらは、マウスの肺感染モデルにおいて、ニンニク抽出物が緑膿菌をトブラマイシン、呼吸バースト、多形核白血球（PMN）による貪食に敏感にすることを発見した[23]。

ニンニクはまた、マウスの尿路感染モデルにおいて、P. aeruginosaの病原性因子の発現を減少させ、クオラムセンシングシグナルの産生を減少させることが判明した[24]。Perssonらは、ニンニク抽出物が6つの臨床細菌単離株に対してバイオフィルム形成抑制効果を示すことを発見した。

さらに、ニンニク由来のすべての化合物の合理的な設計と生物学的スクリーニングを行った結果、強力なクオラムセンシング阻害剤であるN-(ヘプチルサルファニルアセチル)-l-ホモセリンラクトンが同定された。この成分は、転写調節因子LuxRおよびLasRを競合的に阻害することにより、クオラムセンシングシグナル伝達を中断することが実証された[25]。

Cocculus trilobus（アオツヅラフジ）の酢酸エチル画分

Kim SWらは、C. trilobusとCoptis chinensisの薬用植物抽出物がフィブロネクチンでコーティングされた表面への細菌の付着を阻害することを報告した。グラム陽性菌の表面タンパク質とペプチドグリカンとの共有結合を触媒するソーターゼという膜酵素の活性を抑制することで、バイオフィルム形成の接着段階で抗アドヘキシン効果を発揮した。

これら2つの植物の酢酸エチル画分と水画分をスクリーニングしたところ、C. trilobusの酢酸エチル画分が最も高い活性を示し、ソターゼを標的とすることで細菌のアドヘキシンを抑制することがわかった[26]。

クランベリーポリフェノール

クランベリー果実はポリフェノールの豊富な供給源である。研究では、高分子量ポリフェノールを濃縮した非透析性クランベリー画分がバイオフィルムの形成を阻害し、ヒトの病原体、特に病原性細菌の宿主組織への付着やコロニー化を防止することが報告されている[27-30]。

さらに、クランベリーの成分は、グルカン結合タンパク質、細胞外マトリックスの破壊を引き起こす酵素の活性、炭水化物の生成、細菌の疎水性、タンパク質分解活性、バイオフィルム形成に関与する凝集に影響を与えた。

上記のクランベリー成分の潜在的な利点は、特に高分子量ポリフェノールを含む成分が、う蝕や歯周炎などの口腔疾患の予防および／または治療に有望な特性を持つ生理活性分子として機能する可能性を示唆している[31]。

ヘルバ・パトリニアエ（Herba patriniae）抽出物

Fuらは、緑膿菌の6つの主要なバイオフィルム関連遺伝子の発現を検出するためにluxCDABEをベースとしたレポーターシステムを構築した。次に、36種類のハーブ抽出物を用いて、これらの遺伝子に対する阻害作用をスクリーニングした。その結果、Herba patriniaeの抽出物は、これらのバイオフィルム関連遺伝子の大部分に対して有意な阻害効果を示し、それは、P. aeruginosaのバイオフィルム形成の減少と成熟バイオフィルムの構造への干渉と一致することが示された。さらに、H. patriniae 抽出物は緑膿菌のエキソ多糖産生を抑制した。これらの結果から、P. aeruginosaのバイオフィルム関連感染症に対する新薬開発の可能性が示唆された[32]。

イチョウ葉エキス

イチョウ葉抽出物は、ガラス膜、ポリスチレン膜、ナイロン膜の表面における大腸菌O157:H7のバイオフィルム形成を100μg/mlの濃度で、細菌の増殖に影響を与えることなく有意に抑制することが報告された。抑制効果のメカニズムは、イチョウ酸が大腸菌O157:H7のカーリ遺伝子とプロファージ遺伝子を抑制することを明らかにし、これらはフィンブリア産生の減少とバイオフィルムの減少と同列であった[33, 34]。

別の研究では、シンナムアルデヒドがバイオフィルムの形成と構造に影響を与え、大腸菌の遊泳運動性を阻害することが報告されている[35]。Brackmanらは、シンナムアルデヒドおよびシンナムアルデヒド誘導体がビブリオ属のバイオフィルム形成、ストレス応答および病原性を阻害することを発見した。 クオラムセンシング阻害のメカニズムは、LuxRのDNA結合能を低下させることで、様々なビブリオ属におけるAI-2ベースのクオラムセンシングへの干渉を明らかにした[36]。

フロレチン（りんご）

抗酸化物質としてのフロレチン（phloretin）はリンゴに豊富に含まれている。Leeらは、プランクトン細胞の増殖に影響を与えることなく、大腸菌O157:H7株のバイオフィルム形成とフィンブリア産生を著しく減少させることを発見した。

また、フロレチンは大腸菌O157:H7のヒト大腸上皮細胞への付着を抑制し、腫瘍壊死因子α誘導性炎症反応を抑制した。その抑制効果のメカニズムは、フロレチンが大腸菌O157:H7バイオフィルム細胞の毒素遺伝子（hlyEとstx(2))オートインデューサー2インポーター遺伝子（lsrACDBF)カーリ遺伝子（csgAとcsgB)プロファージ遺伝子を抑制することを明らかにした。

このことから、フロレチンはバイオフィルム形成の阻害剤として、また炎症性疾患の抗炎症剤としても作用することが示唆された[37]。また、フロレチンは低濃度でもS. aureus RN4220とSA1199Bのバイオフィルム形成を抑制し、最大70%の抑制効果を示した[38]。

en.wikipedia.org/wiki/Phloretin

リモノイド（柑橘類）

柑橘類のリモノイド（Limonoid）は、トリテルペノイドとしてはユニークな二次代謝物である。精製されたリモノ類は、vibrio harveyi の細胞細胞シグナル伝達とバイオフィルム形成を妨害する能力を示しており、これは luxO 発現の調節に由来すると考えられているが、luxR プロモーター活性の調節には由来しない。

イソリモン酸とイカンジンは、細菌の細胞細胞シグナル伝達の強力なモジュレーターである[39]。イソリムモン酸の阻害作用のメカニズムを調べたところ、イソリムモン酸とイチャンギンは、バイオフィルムやIII型分泌系の強力な阻害剤であることが明らかになった。さらに、イソリモン酸はAI-3/エピネフーリン活性化細胞のシグナル伝達経路をQseBCとQseAに依存して阻害するようである[40]。

Zhouらは最初に、ホルデニンが濃度依存的にシグナル分子の産生を減少させ、食中毒病原体P. aeruginosaのバイオフィルム形成のようなクオラムセンシング制御された表現型をブロックすることを報告した。

ja.wikipedia.org/wiki/リモノイド

ホルデニン（発芽した大麦、ビール）

さらに、ホルデニンはP. aeruginosa PAO1の病原性因子やクオラムセンシング関連遺伝子の発現を効果的に抑制した[41, 42]。ホルデニンの抗クオラムセンシング能は、シグナル伝達分子の競合阻害剤として、また、食中毒病原体を防御するための新規クオラムセンシングベースの薬剤として作用することが示唆されている[41]。

また、ホルデニンと共役するAuNPのようなナノ粒子（NP）も開発され、ホルデニン-AuNPはP. aeruginosa PAO1に対して高い抗バイオフィルム特性を示した[43]。

en.wikipedia.org/wiki/Hordenine

ケルセチン

多くの果物、野菜、穀物に存在するケルセチンは、植物ポリフェノールの一種である。これまでに報告されているほとんどの植物抽出物や物質と比較して、低濃度でバイオフィルム形成やピロシアニン、プロテアーゼ、エラスターゼなどの病原性因子の産生を有意に抑制することが報告されている[44-47]。

クオラムセンシングに関連する転写変化をさらに調査したところ、クオラムセンシングシグナル伝達に関与するLasI、LasR、RhlI、RhlRの発現レベルが有意に低下していることが判明した[48]。ケルセチンは、P. aeruginosaにおけるバイオフィルム形成および病原性因子の効果的な阻害剤であるように思われた。また、シアル酸の発現を抑制することで肺炎球菌のバイオフィルム形成を有意に阻害するSrtAの有効な阻害剤として同定された[49]。

また、バイオフィルム形成やバイオフィルム関連感染症におけるケルセチンの抗バイオフィルム活性をストレプトコッカス・ミュータンス菌やエンテロコッカス・フェカリス菌を用いて調べた結果、ケルセチンはヒトの健康のための抗菌感染症治療や抗カーリ治療への応用の可能性を示した[50,51]。

さらに、ケルセチンをナノ化したナノ粒子やケルセチン結合微粒子は、より効果的な抗バイオフィルム活性を示し[52]、微生物感染症予防のための治療薬開発への新たなアプローチを切り開いた。

その他

また， Rosa rugose tea（ローズ茶）ポリフェノール抽出物，Zingiber officinaleのメタノール画分，各種葉抽出物などの他の天然物や成分も，クオラムセンシングやバイオフィルム形成を抑制する効果を示すことが示されている[53-55]。

Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk.葉のエタノール抽出物は，抗菌剤バンコマイシンよりも黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成抑制効果が高いことが報告されている[56]。

Hymenocallis littoralis（ヒメノカリス）の葉抽出物には複数の生理活性成分（4-methylesculetin, methylisoeugenol, Quercetin 5,7,3′,4′-tetramethyl ether 3-rutinoside, phenols and flavonoids等）が含まれており，病原性微生物やバイオフィルム形成に対して有望な抗菌作用を示した[57]。

ツバキ由来の緑茶抽出物（エピガロカテキン-3-ガレート、EGCG）は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアのバイオフィルム形成を試験管内試験で抑制するだけでなく、C57BL/6およびCftr変異マウスの肺における微生物感染を抑制することができた[58]。

一方、 Rosa rugose tea茶のポリフェノール抽出物は、クオラムセンシング関連ビオラセイン因子を標的とすることで、Chromobacterium violaceum 026,Escherichia coli K-12,P. aeruginosa PAO1のバイオフィルム形成に対しても抗ウォーミング活性を示している[59]。

最近では、エリアニン（Dendrobium chrysotoxum由来)イソビテキシン、パルテノライドなどの天然物が、SrtAを標的とすることで、細胞接着、フィブロネクチンの結合活性、クオラムセンシング因子を阻害し、ブドウ球菌の表面タンパク質A（SpA）のダウンレギュレーション、またはP. aeruginosaに関連する病原性因子を阻害することで、微生物のバイオフィルム形成を阻害することが明らかになってきている[60-62]。

 

天然の抗バイオフィルム剤のスクリーニングの分野は一貫して拡大してきた。上記の抗バイオフィルム剤以外にも、ハーブ[63, 64]、インド薬用植物[65]、天然フェノール化合物[66]、緑茶うがい薬[67]、キノコ[68]、甘草根[69]、ポーランドプロポリス[70]、Allium sativum（にんにく）[71]、Psidium cattleianum leaf（グアバ葉）[72]、[73]、Roselle calyx（アキノキリンソウ）[74]、Juglans regia L.（シナノグルミ） [75]などから抽出されたものが、ここ数年で登場してきた。

これらの研究は、主に一般細菌に対する抗バイオフィルム活性やバイオフィルム関連の生物学的効果の評価などのパイロット研究を行っており、基本的には感染症における抗バイオフィルム治療の可能性を示唆するものであった。しかし、これらの新規な抗バイオフィルム剤は、クオラムセンシングシグナル伝達の制御・制御に関わる分子機構や、抗バイオフィルム活性を発揮する生理活性成分の分子構造など、多くの特性がまだ十分に解明されなかった。

Chamaemelum nobile（ローマンカモミール） の花から抽出した抽出物は、P. aeruginosa の PAO1 株や感染患者から分離された株に対して、クオラムセンシング 活性とバイオフィルムの発生を抑制することが明らかになった[76]。しかし、抗バイオフィルム作用の根底にある分子機構や機能的な構成要素については、さらに調査し、同定する必要がある。

コムギブランもまた、抗バイオフィルム活性を増強し、クオラムセンシングシグナル分子であるアシルホモセリンラクトン（AHL）をダウンレギュレートすることでクオラムセンシングシステムを混乱させることが実証された[77]。バイオフィルム形成や病原性細菌感染を制御するための新しい有効な化合物の開発を目指して、ハトムギブランに含まれる潜在的な有効成分や天然植物からの抽出物を同定するためには、さらなる研究が必要である。

植物からの生理活性抗バイオフィルム成分の分離・抽出

すでに多くのハーブ抽出物がバイオフィルム防止効果を示すことが実証されているが、その生理活性分子や成分はまだ不明であり、さらなる研究が必要とされている。そのため、有効な抗バイオフィルム成分の分離・抽出が重要である。

この10年間で、植物から抗バイオフィルム剤として作用する生理活性成分を同定するために、クロマトグラフィー分離や構造に基づくバーチャルスクリーニング（SB-VS）などの技術が広く検討され、バイオフィルム制御や細菌感染のための新規分子を発掘するための基礎が築かれてきた。また、植物抽出物中の生理活性成分の分離・同定に用いた技術をまとめた（表 2）。以下、これらの技術について簡単に説明する。

表2 植物からの生理活性抗バイオフィルム成分の分離・抽出

工場	生物活性成分	方法論	参考文献
アッサムティー	ガロイル化カテキン	HPLC	[ 78 ]
いくつかの一般的な食品と植物	イベリン	LC-DAD-MSおよびNMR分光法	[ 79 ]
ココナッツ殻エキス	1つの生物活性OH基含有化合物	TLC、HPLCおよびFT-IR分析	[ 80 ]
タイの12のハーブ	4-クロマノール	GC-MS分析、TLCフィンガープリント、TLC-バイオオートグラフィー	[ 81 ]
Schinusterebinthifolius	フェノール化合物、アントラキノン、テルペノイド、およびアルカロイド	TLC分析	[ 82 ]
ザクロ抽出物	エラグ酸	HP-TLC分析	[ 83 ]
薬用植物		UPLC分析	[ 84 ]
1920天然化合物/薬物	ロスマリン酸、ナリンギン、クロロゲン酸、モリン、マンギフェリン	LasRおよびRhlR受容体に対するSB-VS	[ 85 ]
3040の天然化合物とその誘導体。	5-イミノ-4,6-ジヒドロ-3H-1,2,3-トリアゾロ[5,4-d]ピリミジン-7-オン	クオラムセンシング受容体LasRに対するSB-VS	[ 46 ]
漢方薬（TCM）からの51の生物活性成分	バイカレイン	転写活性化タンパク質TraRに対するSB-VS	[ 86 ]
TCMからの46の生物活性成分	エモジン	転写活性化タンパク質TraRに対するSB-VS	[ 87 ]
天然および合成化合物ライブラリ	4-NPO	クオラムセンシング阻害剤セレクターという名前のスクリーニングシステム	[ 88 ]
5つの市販のお茶の抽出物	高分子および単量体の茶フェノール	植物化学物質のスクリーニング	[ 89 ]

クロマト分離

お茶（アッサム茶）

河原井らは、茶がストレプトコッカス・ミュータンスの表面への付着とその後のバイオフィルム形成を抑制できることを報告している。アッサム茶は緑茶よりもS.ミュータンスに対してより強力な抗バイオフィルム活性を示した。アッサム茶に含まれるクオラムセンシング阻害剤の精製と同定には、遠心ろ過装置を用いた限外ろ過と高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いた。その結果，アッサム茶に含まれる分子量10kDa以下の物質は，緑茶に比べてガロイル化カテキンの濃度が高く，強い抗バイオフィルム活性を有していた。しかし、緑茶に含まれる質量が10 kDaを超えるペクチンなどの多糖類は、バイオフィルム形成を促進することが判明した[78]。

イベリン（アブラナ科）

別の研究では、いくつかの一般的な食品や植物を抽出してスクリーニングし、活性な クオラムセンシング阻害剤 活性を持つ未知の成分を分離した。アブラナ科のイソチオシアネートであるイベリンは、液体クロマトグラフィー・ダイオードアレイ検出器質量分析法（LC-DAD-MS）と核磁気共鳴（NMR）分光法によって同定された。クオラムセンシング制御遺伝子の抑制は、リアルタイムPCR（RT-PCR）およびDNAマイクロアレイアッセイによってさらに実証された[79]。

ヤシ殻抽出物（CHE）

Pseudomonas spp. 、Alteromonas spp. 、およびGallionella spp.のバイオフィルム形成に関与する細胞外高分子物質（EPS）産生、疎水性、および接着能力に対するヤシ殻抽出物（CHE）の効果を試験した。その結果、CHEは細菌細胞のEPS産生と疎水性に影響を与えるとともに、すべての細菌株に対して抗菌活性を示すことがわかった。薄層クロマトグラフィー（TLC)HPLCおよびフーリエ変換赤外（FT-IR）アッセイで分析したところ、CHEの1つの生理活性OH基含有化合物が抽出物中に発見された [80]。

Piper betle（キンマ）

Teanpaisan氏らは、タイで12種類のハーブの抗バイオフィルム活性を試験した。タイの伝統的な12種類のハーブの中で、口腔内病原体に対して最も強力な抗バイオフィルム剤として作用したのはPiper betle（キンマ）であった。その結果、バイオフィルムの予防と根絶を含む二重の作用を示した。GC-MS分析、TLCフィンガープリンティング、TLCバイオオートグラフィーで特徴づけられた生理活性化合物は、Piper betle抽出物の主成分である4-クロマノールであり、口腔内病原体に対する抗菌・抗バイオフィルム効果があることが実証されている[81]。ブラジルでは、民間療法でいくつかの健康障害の治療に用いられている人気のある植物で、抗菌性、抗炎症性、抗潰瘍性を示すことがわかっている。Barbieriらは、S. terebinthifoliusがカンジダ・アルビカンスのバイオフィルム形成と付着を効率的に抑制することを発見した。TLC分析の結果、S. terebinthifoliusの抽出物には、フェノール化合物、アントラキノン、テルペノイド、アルカロイドなどの生理活性化合物が含まれていた。この結果は、口腔内バイオフィルムに関連する口腔疾患の治療予防における天然物の応用の可能性を示唆している[82]。

en.wikipedia.org/wiki/Betel

ザクロ

ザクロは一般的な果物であり、様々な病気を治療するために伝統的に利用されている。ザクロのメタノール抽出物を用いて、細菌および真菌病原体に対する抗バイオフィルム活性を検出した。その結果、ザクロのメタノール抽出物は、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、大腸菌、カンジダ・アルビカンスなどの細菌が産生するバイオフィルムの形成を抑制することがわかった。さらに、ザクロ抽出物は、C. albicansの病原性に関しても生殖管形成を阻害した。ザクロ抽出物の主成分を決定するために、高圧薄層クロマトグラフィー（HP-TLC）を行った。その結果、主成分としてエラグ酸の存在が明らかになった[83]。薬用植物は重要な供給源であり、感染症の治療薬として伝統的に使用されてきた。本研究では、Betula pendula, Equisetum arvense, Herniaria glabra, Galium odoratum, Urtica dioica, Vaccinium vitisidaea を含むいくつかの植物抽出物が、病原性大腸菌桿菌の病原性因子の発現とバイオフィルム形成に及ぼす影響を調べることを目的とした。化合物の同定は、四重極時飛行（Q-TOF）MS装置（UPLC-Q-TOF-MS）と結合したAcquity超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）システムを用いて行った。これらの薬用植物の抽出物は、すべてバイオフィルム防止活性を示した。また、一部の抽出物は大腸菌の増殖、表面疎水性、運動性を抑制する効果を示した[84]。

構造に基づくバーチャルスクリーニング（SB-VS)

これまでに多くの研究により、クオラムセンシングシステムは抗菌薬の新たなターゲットとして有望視されていた。本研究では、緑膿菌のクオラムセンシングシグナル伝達経路に存在する標的に対して、構造に基づいたバーチャルスクリーニング（SB-VS）とin silicoドッキング解析を用いて、緑膿菌のクオラムセンシング阻害剤と考えられる化合物を探索した。約2000種類の天然化合物の中から、緑膿菌のLasR及びRhlR受容体に対する上位5種の化合物をスクリーニングした。上位5化合物、すなわちロスマリン酸、ナリンジン、クロロゲン酸、モリンおよびマンギフェリンの薬理作用をPAO1株および2つの抗生物質耐性臨床分離株に対して試験管内試験バイオアッセイを行った。これらの化合物のほとんどは、病原性因子の産生を有意に抑制し、バイオフィルムに関連する行動を潜在的に抑制した[85]。別の研究では、3040種の天然化合物およびその誘導体から新規のクオラムセンシング阻害剤候補をスクリーニングするためにSB-VSアプローチを使用した。クオラムセンシング受容体LasRを標的として、ドッキングスコアと分子量に基づいて22の化合物を得て、クオラムセンシング阻害剤としての有効性を決定するためにさらなる調査を行った。クオラムセンシングのライブレポーターアッセイを用いて、5つの化合物が緑膿菌のクオラムセンシング制御遺伝子発現を用量依存的に抑制し、緑膿菌PAO1のプロテアーゼIV、キチナーゼ、ピオーバージン合成酵素など、いくつかのノルムセンス制御された病原性因子を含む46のタンパク質（19がアップレギュレート、27がダウンレギュレート）を明らかに制御することが実証された[46]。

バイカレイン

漢方薬（TCM）は クオラムセンシング阻害剤 スクリーニングのための膨大なデータベースを提供している。コンピュータベースのバーチャルスクリーニングを用いて、P. aeruginosaのクオラムセンシング阻害剤をスクリーニングしたところ、抗菌活性を持つ51種類の漢方薬の生理活性成分が検出された。その結果、バイカレインは緑膿菌のバイオフィルム形成を抑制し、緑膿菌の増殖を抑制しなかった。Baicaleinは、大腸菌におけるシグナル受容体TraRタンパク質のタンパク質分解を促進した[86]。分子ドッキングに基づく別のバーチャルスクリーニングでは、TCM からの 46 の生理活性成分の中から 6 つの化合物が クオラムセンシング阻害剤 の候補として発見された。そのうち3つの化合物は、緑膿菌およびステノトロフォモナス・マルトフィリアに対して抗バイオフィルム効果を示した。

さらに、エモジンは、大腸菌のクオラムセンシングにおけるシグナル受容体TraRのタンパク質分解を促進し、バイオフィルム形成を有意に抑制した。エモジンはP. aeruginosaに対するアンピシリンの活性を増加させた[87]。したがって、エモジンやバイカレインのようなTCMの成分は、抗ウイルス・抗菌治療のための新規なターゲットを持つクオラムセンシング阻害剤として開発される可能性がある。

これらの相互作用研究は、SB-VSが標的特異的クオラムセンシング阻害剤の発見に有用であることを示しており、クオラムセンシング制御されたバイオフィルム形成や病原性因子の産生を阻害する可能性があることを示している。

その他

上記の2つの方法論の他に、抗バイオフィルム剤の発見のために他のスクリーニング技術も採用された。Rasmussenらは、クオラムセンシング阻害剤セレクターと呼ばれるスクリーニングシステムの集合体を構築し、天然および合成化合物ライブラリーの中から新規クオラムセンシング阻害剤を選択した。その結果、ニンニク抽出物と4-ニトロ-ピリジン-N-オキシド（4-NPO）が最も生理活性の高い成分としてクオラムセンシング阻害剤セレクターによって同定された。さらに、クオラムセンシング制御された病原性遺伝子に対する特異性や薬理効果は、GeneChipを用いたトランスクリプトーム解析や線虫の病原性モデルで実証された[88]。

5 種類の市販茶抽出物を用いて、S. mutans の 2 つの菌株による付着およびバイオフィルム形成に対する阻害効果についてスクリーニングを行った。さらに、走査型電子顕微鏡(SEM)とフィトケミカルスクリーニングを用いた。その結果、ウーロン茶及びプーアール茶の抽出物は、それぞれS. mutansの付着及びバイオフィルム形成を最も効果的に抑制することが示された。本研究で得られた茶抽出物の細胞付着およびバイオフィルム形成抑制効果は、抽出物中に含まれる大きな分子、あるいは重合性および単量体性の茶フェノリックの相乗効果によって誘導されている可能性がある。この研究では、細胞表面の特性の改変、タンパク質の活性の遮断、細菌が表面と相互作用するために使用する構造の変化などの潜在的なメカニズムが示唆されており、これがS. mutansの細胞付着およびその後のバイオフィルム形成に対する茶成分の阻害効果を説明できる可能性がある[89]。臨床評価中の天然の抗バイオフィルム剤

これまでのところ、感染症に対する抗バイオフィルム剤は、米国食品医薬品局（Food and Drug Administration）に承認されたものはまだない。しかし、天然の抗バイオフィルム剤は臨床試験で全身的に検討されており、有望な展望が示されている。抗バイオフィルム剤を単一の抗バイオフィルム剤として患者を対象とした様々な臨床第 I 相、第 II 相、第 III 相、第 IV 相試験が実施されているが（http://clinicaltrials.gov/ で報告されている)完了した臨床試験の中には、まだ結果が掲載されていないものもある。http://clinicaltrials.gov/are からアウトカムが報告されているリソースを表 3 に示す。

表 3 臨床評価中の天然の抗バイオフィルム剤(http://clinicaltrials.gov/)

天然物に関する臨床試験では、抗菌効果や抗バイオフィルム活性で良好な結果が得られたものがいくつかあり、表 4 に示すとおりである。これらの臨床試験の多くは，天然物をマウスウォッシュやデンティフライスの成分として使用することで，義歯移植患者や歯の炎症・口腔疾患患者に対する抗菌・抗バイオフィルム効果に焦点を当てたものであった。口内炎を有する義歯装着者を対象とした臨床試験が行われ，S. mutansやCandida spp.に対して良好な抗菌効果を示した[90, 91]．

緑茶とSalvadora persica L.の水性抽出物やMatricaria chamomomilla L. (MTC)抽出物などのハーブ抽出物を配合したマウスウォッシュは，歯のバイオフィルムコントロールに有意な効果があり，プラークコロニー化を有意に減少させることが臨床試験で報告されている[92, 93]．

また、精油を含むマウスウォッシュは歯の細菌を殺すのにも効果的である可能性がある。中等度の慢性歯周炎患者を対象とした無作為化比較臨床試験では、Cymbopogon flexuosus、Thymus zygis、Rosmarinus officinalisの精油とマウスウォッシュを併用することで、耐容性の良い患者では歯肉下層での抗バイオフィルム効果があることが示されている[94]。

無作為化二重盲検試験で示されたように、レモングラスオイルからなるマウスリンズは8日間の治療で口腔内の悪臭を減少させた。また、天然成分であるMelaleuca alternifoliaの精油や植物油を配合した歯磨き粉は、市販の歯磨き粉と比較して、歯列矯正治療を受けている患者や虫歯のある患者において、高い抗菌効果とバイオフィルムコントロール効果を示した[96, 97]。

尿路感染症（UIT）に対する天然の抗バイオフィルム製品の治療に関連した臨床試験もいくつかあった。クランベリー抽出物（プロアントシアニジン-A、PAC-A）の経口摂取は尿路感染症の予防に重要な役割を果たしていると考えられ[98]、クランベリー抽出物、ソリダゴ、オルトシホン、シラカバを配合した製剤（CISTIMEV PLUS®）は尿路カテーテル留置患者の細菌蓄積を明らかに減少させたとの臨床結果がある[99]。

一方で、サンプル数が限られていたり、治療時間が異なることなどから、有望な結果が得られなかった臨床試験もあったようである[100]。また、これらの臨床試験の多くは、天然成分が細菌の生存率やバイオフィルム形成を抑制する効果を示しており、天然抗バイオフィルム剤の臨床応用の可能性を示唆するものであった。

全体として、サンプルサイズはいずれも30～70名程度であり、サンプルサイズを拡大して最適化した研究を行う必要があることがわかった。これらの臨床試験は義歯や口内関連の臨床試験が中心であることから，より多くの感染症を対象とした天然型抗バイオフィルム剤の臨床評価が可能となることが期待される。

表4 臨床評価中の天然型抗バイオフィルム剤のアウトカム

研究	状態	介入	結果	参考文献
ランダム化比較臨床試験	義歯口内炎の義歯装着者（n = 64）	コントロール、0.85％生理食塩水 SH1、0.25％次亜塩素酸ナトリウム SH2、0.5％次亜塩素酸ナトリウム RC、10％Ricinus communis	Ricinus communisは、S。mutansおよびCandidasppに対して抗菌活性を示しました。	[ 90 ]
ランダム化クロスオーバー臨床試験	義歯口内炎の義歯装着者（n = 50）	コントロール、0.85％生理食塩水 SH1、0.1％次亜塩素酸ナトリウム SH2、0.2％次亜塩素酸ナトリウム RC、8％Ricinus communis	Ricinus communisは義歯口内炎の症状を緩和しましたが、抗バイオフィルム効果は明ら​​かではありませんでした	[ 91 ]
ランダム化比較試験	歯垢（n = 14）	コントロール、 0.25 g / ml緑茶と7.82g / ml Salvadora persica L.水性抽出物を含む0.12％クロルヘキシジン試験製剤 プラセボマウスウォッシュ	テストマウスウォッシュは、短時間の治療（24時間）でプラセボおよび対照群と比較した場合、プラークコロニー形成の破壊に有意にプラスの効果があります	[ 92 ]
ランダム化二重盲検対照試験	固定器具による矯正治療を受けている患者（n = 30）	C：プラセボ T1：1％Matricaria chamomilla L.（MTC）抽出物を含むうがい薬 T2：0.12％クロルヘキシジン（CHX）	MICはバイオフィルムの発達と歯肉出血を抑制する可能性があります	[ 93 ]
ランダム化比較臨床試験	スケーリングおよびルートプレーニング（SRP）後の中等度の慢性歯周炎の患者（n = 46）	プラセボうがい薬（n = 23） エッセンシャルオイル（Cymbopogon flexuosus、Thymus zygis、Rosmarinus officinalis）からなるエッセンシャルオイルうがい薬（n = 23）	SRP後のエッセンシャルオイルを含むうがい薬の併用は忍容性が高く、14日間の治療で歯肉縁下に抗バイオフィルム効果がありました。	[ 94 ]
ランダム化二重盲検臨床試験	経口悪臭（n = 20）	レモングラスオイル（LG）うがい薬	LGマウスウォッシュは、Aggregatibacter actinomycetemcomitansATCC43718およびPorphyromonasgingivalis W50に対して選択的な抗菌効果を示し、8日間の治療で経口悪臭を軽減する可能性があります。	[ 95 ]
ランダム化比較試験	歯科矯正患者（n = 34）	メラルーカジェル：メラルーカオルタニフォリア コルゲートトータルのエッセンシャルオイルで開発されたジェル	メラルーカゲルは、歯垢と細菌コロニーの数を減らすのにより効果的でした	[ 96 ]
ランダム化比較試験	齲蝕と歯周病（n = 30）	G1：A市販の歯磨剤 G2：歯磨剤を含む鉱物油（ヌジョール®） G3：歯磨剤を含有する植物油（アルファケア®）	鉱油と野菜のグループの両方が改善されたバイオフィルム制御を示し、臨床における歯のバイオフィルム形成を大幅に減少させる可能性があります	[ 97 ]
ランダム化比較試験	無症候性または合併症のない再発性UTI（r-UTI）の患者（n = 72）	プラセボ（n = 36） クランベリー抽出物（PAC-A、プロアントシアニジン-A）（n = 36）	栄養補助食品として（PAC-A）を含む標準化されたクランベリー抽出物の全体的な有効性と忍容性は、細菌付着の減少という点でプラセボよりも優れていました。バイオフィルム開発; 尿のpH低下; r-UTI（排尿障害、細菌尿症、膿尿症）の予防	[ 98 ]
単一盲検、ランダム化および対照パイロット研究	尿道カテーテルを留置している患者（n = 83）	コントロール（N = 35） CISTIMEV PLUS ®：ソリダゴ、オルソ、カバノキおよびクランベリー抽出物（N = 48）	CISTIMEV PLUS ®の患者で有意に低下した微生物の蓄積	[ 99 ]
パイロットランダム化比較試験	緑膿菌関連の肺嚢胞性線維症（n = 34）	プラセボグループ ニンニクまたはオリーブオイル治療グループ	ニンニクとオリーブオイルのカプセルはどちらも許容されましたが、抗菌作用に有意な効果は見られませんでした	[ 100 ]

結論と視点

バイオフィルムは、抗生物質や抗菌薬に対する耐性の増加とともに同定され、人間の医療に厄介な負担をかけている。バイオフィルム関連感染症の治療は、現在、臨床医や微生物学者にとって複雑な課題となっている。微生物感染症における抗生物質耐性の問題を克服するための新規抗菌薬戦略の開発が急務となっている。

今回のレビューで示されているように、自然資源は抗バイオフィルム剤のスクリーニングのための巨大なライブラリーを提供してくれた。近年、植物や自然食品の健康増進効果についての研究が盛んに行われるようになってきた。これまでの研究では、天然物が細菌のバイオフィルム形成・発達に及ぼす抑制効果が検討されており、細菌感染症の代替薬としての可能性が示唆されている。今回の調査結果によると、天然の抗バイオフィルム剤の多くは、様々な細菌種における抗バイオフィルム効果について、前臨床試験で有望なデータを示した。これらの抗バイオフィルム剤の潜在的な制御機構は、主にバイオフィルム形成の各段階の抑制やクオラムセンシングネットワークの阻害によるものであった。過去20年の間に、クロマトグラフィー分離などの技術を用いたバイオフィルム防止剤のスクリーニングが行われ、有効成分の単離への道が開かれてきた。しかし、植物由来の抗バイオフィルム活性を有する抽出物については、生理活性分子の分子構造が明らかになっていないものが多く、今後の研究の必要性が指摘されている。また、天然の抗バイオフィルム剤をベースとした抗感染症治療薬の第I～IV相臨床試験が進行中であることは心強い。現在進行中の臨床試験では、歯垢、歯周炎、歯肉炎などで発生した口腔内バイオフィルムを対象とした外用試験が主に行われている。内臓、組織、その他の臓器などに深い位置にバイオフィルム関連の感染症を有する臨床患者を対象に、天然物の有効性と耐性を評価することは価値のあることである。一方、臨床応用における天然抗バイオフィルム剤の開発と評価には、特異性、安全性、効率性の向上、単独または他の抗生物質との併用も必要であり、これは細菌感染症の制御に大きな影響を与え、世界中のヒートシーケアに多くの利益をもたらすであろう。

略語

AHLアシルホモセリンラクトン
AIPオートインデューサーペプチド
BAPバイオフィルム関連タンパク質
CHEココナッツハスクエキス
細胞外マトリックス細胞外マトリックス
EGCGエピガロカテキン-3-ガレート
エフティーアイアールフーリエ変換赤外
HPLC高速液体クロマトグラフィー
LC-DAD-MS 液体クロマトグラフィー-ダイオードアレイ検出器-質量分析計
MTC Matricaria chamomomilla L.
NPナノ粒子
NMR核磁気共鳴
PCLプログラムされた細胞溶解
PAC-A プロアントシアニジン-A
PMN多形核白血球
クオラムセンシングクオラムセンシング
クオラムセンシング阻害剤 クオラムセンシング阻害剤
SB-VS構造に基づく仮想スクリーニング
走査型電子顕微鏡（SEM
SrtA ソターゼA
スパ表面タンパク質抗原
SpA ブドウ球菌プロテインA
TCM 伝統的な中国の薬
TLC薄層クロマトグラフィー
UPLC超高性能液体クロマトグラフィー
4-NPO 4-ニトロピリジン-N-オキシド