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Daytime variation in SARS-CoV-2 infection and cytokine production
pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34175433/
2021年6月24日
ハイライト
- サーカディアンリズムとSARS-CoV-2感染症との関連。
- SARS-CoV-2感染の日にちが、ウイルスの感染／複製を調節する。
- SARS-CoV-2感染の日中時間が免疫反応に影響を与える。
概要
S. RayとA. Reddyは最近、コロナウイルス感染症（COVID-19）の原因ウイルスである重症急性呼吸器症候群新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）における概日リズムの関与を予想した。概日リズムは、生体機能の調節に重要な役割を果たしているだけでなく、ウイルス感染症の調節因子としても示唆されている。特に、インフルエンザウイルス、呼吸器シンシアルウイルス、パラインフルエンザ3型ウイルスなどで報告されているように、感染時の時間帯が病気の進行に重要であることがわかっている。
我々は、SARS-CoV-2ウイルス感染におけるサーカディアンリズムの関与を、COVID-19感染症の主要なアクター細胞である健常者から単離したヒト単球を用いて解析した。遺伝子の概日的な発現をq-RTPCRで調べた。単球にSARS-CoV-2ウイルス株を感染させ、ウイルス感染をOne-Step qRT-PCRと免疫蛍光法で調べた。
また、感染した単球の上澄み液中のインターロイキン（IL）-6,IL-1β、IL-10のレベルを測定した。Cosinor解析を用いて、BMAL1とCLOCKの転写産物が、サーカディアンタイム(CT)6とCT17にアクロフェーズとバティフェーズを持つ単球のサーカディアンリズムを示すことを示した。
48時間後、CT6に感染した単球では、CT17に比べてSARS-CoV-2ウイルスの量が増加した。CT6でのウイルス量の増加は、CT17と比較して、IL-6,IL-1β、IL-10の放出量の有意な増加と関連していた。
これらの結果は、SARS-CoV-2の感染時期がウイルス感染や宿主の免疫反応に影響することを示唆している。これらの結果は、SARS-CoV-2の病気の進行における概日リズムの考慮を支持するものであり、概日リズムをウイルスの進行を管理するための新たなターゲットとして提案するものである。
キーワード
COVID-19、サーカディアンリズム、単球炎症性、サイトカイン
1. はじめに
近年，重症急性呼吸器症候群新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）の発症機構にサーカディアンリズム（CR）が関与していることが予想されている[1]。サーカディアンリズムは，生物の生理的プロセスを24時間の周期で制御するものである[2]。リズムは，中枢および末梢の振動子に依存しており，その活動は，主要な時計遺伝子BMAL1の制御下にある時計遺伝子カスケードによって管理される2つの主要なフィードバックループに依存している[2]。微生物に対する宿主の感受性は，おそらく体内時計の制御下にあると考えられる[3]。インフルエンザウイルス，呼吸器シンシチアルウイルス，パラインフルエンザ3型ウイルスなどで報告されているように，感染した時間帯が病気の進行に重要である[[4], [5], [6]]。我々は以前、CRが感染感受性、臨床症状、および感染症の予後の接点で重要な役割を果たしていることを報告した[3,7]。
SARS-CoV-2感染症におけるCRの役割を予想させるいくつかの証拠がある。Bmal1の欠如は、コロナウイルスの細胞内複製、特に小胞輸送、小胞体およびタンパク質生合成に影響を与える[8]。BMAL1をノックアウトすると，デング熱やジカ熱などのいくつかのウイルスの複製が著しく低下する[9]。最後に、最近発表されたSARS-CoV-2と宿主との相互作用に関与する主要なタンパク質のうち、30%が概日経路に関連していることが確認されている[1]。SARS-CoV-2のヒト細胞への感染にCRが関与していることを示す証拠は明らかに不足している。本研究では、COVID-19の影響を受ける自然免疫細胞であるヒト単球のSARS-CoV-2感染とサイトカイン産生が、CRによって制御されているかどうかを調べた。
2. 結果と考察
まず、安静時の単球のサーカディアンオシレーションを調べた。24時間の間、3時間ごとに全RNAを抽出し、無刺激の単球におけるBMAL1およびCLOCK遺伝子の発現を調べた。調査した遺伝子の発現は、単球ではCRを示し、概日時間（CT）6とCT17で、それぞれacrophase（リズムのピーク）とbathy phase（リズムの谷）が見られた（図1A、表1）。これらの2つの時点は，ヒトの活動期と休息期の始まりを表している[11]。SARS-CoV-2の単球への感染にCRが関与しているかどうかを評価するために、単球にSARS-CoV-2をバティフェーズ（CT6）またはアクロフェーズ（CT17）で48時間培養した。図1Bに示すように、単球へのウイルスの取り込みはCT6の方がCT17よりも高かった。さらに、SARS-CoV-2のRNAウイルスの量（図1C）と力価（図1D）は、CT6で感染させた単球の上清の方がCT17よりも多いことが示された（図1B）。我々のデータは、ヒト単球におけるSARS-CoV-2の侵入と増殖が、時間帯によって異なることを初めて示した。この発見は、これまでにヘルペスウイルスやインフルエンザウイルスのマウス感染モデルで報告されている内容を彷彿とさせるものである[6]。このように、ネズミとヒトではCRが異なるため、SARS-CoV-2感染症の病態を理解するための外挿は困難であることが注目される。
図1 SARS-CoV-2の感染経路 SARS-CoV-2感染はサーカディアンリズムと関連している
(A) 4人のドナーから採取したコジノールモデルを用いた単球におけるBMAL1遺伝子とCLOCK遺伝子の概日リズム。(B) 少なくとも3人の異なるドナーを用いて3回繰り返した実験でのCT6およびCT17時のウイルス量（n = 4）と力価（n = 3）。C）SARS-CoV-2ウイルス（赤）に感染した単球（緑はF-actin、青は核）の代表的な写真と貪食活性。結果は、4人のドナーによる3回の独立した実験の平均±SEMで表した。D）CT6およびCT17における非刺激細胞（赤）および感染細胞のIL-6,IL-1βおよびIL-10のレベル。結果は、3回の独立した実験を行った4人のドナーの平均として表されている。… (この図の凡例にある色への言及の解釈については、読者はこの論文のウェブ版を参照してほしい)。
表1 BMAL1遺伝子とCLOCK遺伝子のリズミックパラメータ（メソール、振幅、先端位相）。
| 遺伝子 | ドナー | Mesor | P値 | 振幅 | P値 | アクロフェーズ | P値 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| BMAL1 | 1 | −2.33 | <0.001 | 0.23 | 0.05 | 16.37 | 0.03 |
| 2 | −2.40 | <0.001 | 0.20 | 0.003 | 16.91 | <0.001 | |
| 3 | −2.64 | <0.001 | 0.28 | 0.008 | 17.12 | 0.02 | |
| 時計 | 1 | −2.92 | <0.001 | 0.16 | <0.001 | 17.20 | <0.001 |
| 2 | −2.90 | <0.001 | 0.09 | 0.03 | 15.29 | 0.007 | |
| 3 | −2.96 | <0.001 | 0.33 | 0.03 | 17.83 | 0.001 |
COVID-19感染症は、IL-6,IL-1β、IL-10などのサイトカインの高い循環レベルからなるサイトカイン・ストームを引き起こす免疫系の暴走を特徴としている[12]。我々は、SARS-CoV-2と単球との相互作用が、CRの2つのポイントでのサイトカイン産生に影響を与えているかどうかを調べた。その結果、IL-6,IL-1β、IL-10の量は、感染量が最も多いCT6で有意に増加した（図1E）。したがって、SARS-CoV-2と単球の相互作用は、日中に応じて異なるサイトカインパターンをもたらした。
このように、SARS-CoV-2に感染した時間帯によって、ウイルスの感染・複製と宿主の免疫反応が一貫して決まることがわかった。SARS-CoV-2は、自らの利益のために時計経路を利用している可能性が高いと考えられる。今回の結果は、SARS-CoV-2の病気の進行にCRが関与していることを裏付けるものであり、CRがウイルスの進行を管理するための新たなターゲットであることを示唆している。また、CRがいくつかの薬剤の薬物動態を制御していることが判明したため、本研究では、COVID-19患者への治療薬投与時期の重要性も強調している[13]。COVID-19の重症化を防ぐために、いくつかの治療法が提案されている。それらには、受動免疫、サイトカイン、抗サイトカイン抗体、コルチコイドなどがある[14]。これらの候補はすべて、日中に振動することが知られている免疫反応に影響を与え、SARS-CoV-2のCRに応じて投与される。最後に、集中治療室におけるCRの乱れが十分に証明されていることから[15]、重度のCOVID-19患者の臨床および治療管理において考慮すべきである。
3. 方法
3.1. 細胞とウイルス
SARS-CoV-2株MI6は、Vero E6細胞（American type culture collection ATCC® CRL-1586™）を用いて、Minimum Essential Media（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）に4%のウシ胎児血清（FBS）を添加して培養した。ウイルスの力価は，感染したVero E6細胞の50%に細胞障害を引き起こすウイルスの量に対応するTCID50法を用いて評価した。
匿名の健康なドナー（n=4，男性1名（38歳），女性3名（28歳，34歳，39歳））の血液を，ある時点でロイコパック（規約番号7828，Etablissement Français du Sang，Marseille，フランス）から採取し，末梢血単核細胞（PBMC）を取り出して凍結した。実験開始時に、MACS磁気ビーズ（Miltenyi Biotec, Bergisch, Germany）を用いてCD14選択後、各ドナーのPBMCからヒト単球を分離した[16]。選択後のCD14細胞の純度は98%であった。単球（5.105細胞／ウェル）は、10%のFBS、100U／mLのペニシリンおよび50μg／mLのストレプトマイシン（Life Technologies社）を含むRoswell Park Memorial Institute medium-1640（Life Technologies社）で培養した。
分離後、12時間培養した後、50μlのウイルス懸濁液（0.1感染多重度（MOI））をバティフェーズ（CT6）およびアクロフェーズ（CT17）に感染させ、5%CO2存在下、37℃で48時間培養した。
3.2. サーカディアン遺伝子発現
単離単球を12時間培養した後、深夜から3時間ごとに24時間のサーカディアンリズムを評価した。トータルRNAをRNA Mini Kit（Qiagen社）を用いて抽出し、メーカーの説明書に従って定量的Real-Time PCRを行った（MMLV Kit, Life Technologies社、Smart SYBRGreen kit, Roche Applied Science社）。BMAL1を標的とした特異的プライマーを用いて，サーカディアン遺伝子の発現を調べた（5′-3′AAACCAACTTTTCTATCAGACGATGAA; 3′-5′ TCGGTCACATCCTACGACAAAC）およびCLOCK（5′-3′ AAGTTAGGGCTGAAAGACGACG;3′-5′ GAACTCCGAGAAGGCAGAAG）遺伝子を標的とした特異的プライマーを用いて調べた[7]。結果は，このハウスキーピング内在性遺伝子が経時的に振動しないことが以前に観察されているので，ACTB遺伝子（β-actin）（5′-3′ GGAAATCGTGCGTGACATTA; 3′-5′ AGGAAGGAAGGCTGGAAG）を用いて正規化した[17,18]。結果は，適切な式に従って表される：遺伝子発現=Log（2-ΔCt）相対発現，Ct（Cycle threshold），ΔCt=Ct標的遺伝子-Ctβ-actin．時計遺伝子BMAL1およびCLOCKのCRの評価には、24時間にわたる数点の測定値からの外挿に基づくCosinor解析を用いた。
3.3. ウイルスRNAの抽出とPCR
NucleoSpin® Viral RNA Isolation kit（Macherey-Nagel社）を用いて感染細胞の上清からウイルスRNAを抽出し、遺伝子EをターゲットとしたOne-Step qRT-PCR SuperScript™ III Platinum™（Life Technologies社）を用いてCOVID-19ウイルスの検出を行った。
3.4. 免疫蛍光法
感染細胞（5.105 cells/well）を固定し、ファロイジン-555および4′,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）とインキュベートして、F-actinと核をそれぞれ標識した。SARS-CoV-2ウイルスは，最初に抗SARS-CoV-2抗体（Spike protein, Thermo Fisher）を，次に二次抗ウサギAlexa 647（Thermo Fisher）を用いて標識した。
共焦点顕微鏡（LSM 8000 Airyscan共焦点顕微鏡、63倍、油性対物レンズ）を用いて写真を取得し、単球の貪食活性を次の式に従って貪食指数として決定した（各ドナーについて100個の細胞を評価）：貪食率（（（平均感染細胞数×100）／カウントされた細胞の総数）×粒子またはウイルスの平均数／細胞）。
3.5. イムノアッセイ
インターロイキン（IL）-6,IL-1βおよびIL-10のレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ法（R＆D systems社）を用いて細胞上清中で測定した。アッセイの感度は（pg/ml)IL-6が15.4,IL-1βが0.125,IL-10が3.9であった。
3.6. 統計解析
統計解析はGraphPad Prism (7.0, La Jolla, CA)およびR studio v3.4.0を用いて行った。連続変数は中央値±四分位数で表し、2群間の比較は、マッチしていないデータはMann-Whitneyノンパラメトリック検定、マッチしたデータはStudent t-testを用いて行った。
CR解析では，Cosinor変換を用いて，ある変数の24時間の変動を推定した。調査したCRパラメータは，アクロフェーズ（最大活動までの経過時間）とその逆のバティフェーズ，アンプリチュード（考慮したリズムの最大変動の半分），メソール（平均遺伝子発現量）である。有意なCRとは，3つの概日リズムパラメータが統計的に有意である場合をいう。統計的有意性はP≦0.05と定義した。