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II型膜貫通型セリンプロテアーゼ 覚書
TMPRSS2
COVID-19のアウトカムのためのバイオマーカーの可能性
accp1.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jcph.1641
COVID-19への影響を与えないACE2の発現
アンジオテンシンI変換酵素2（ACE2）およびTMPRSS2は、インフルエンザおよびSARS-コロナウイルス（CoV）感染、ならびにSARS-CoV-2ではウイルスの宿主細胞への侵入を媒介することが示唆されている2。
ACE2は両ウイルスのスパイク蛋白質の主な受容体であるが、その発現および遺伝子多型はSARSまたはCOVID-19の性特異的効果または転帰に影響を与えなかった（執筆時点ではまだ査読を受けていない、medRxivに掲載された2つの最近のプレプリント研究に基づく）4, 5。
TMPRESS2とは
TMPRSS2 は、アンドロゲン応答性セリンプロテアーゼであり、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質を切断し、ウイルスの侵入と活性化を促進する。8 TMPRSS2のアンドロゲン制御プロモーターは、前立腺癌と強く関連し、多くの生物学的プロセスを制御している原発癌性ETS転写因子ファミリーメンバーのコード領域と融合遺伝子を形成している。
TMPRSS2は心臓内皮、腎臓、消化管でも発現しており、これらがSARS-CoV-2感染の重要な標的臓器である可能性が示唆されている6。実際、COVID-19の臨床症状には、病院に来院した患者の急性心筋損傷、肝酵素上昇、急性腎障害による合併症だけでなく、地域社会で軽症の患者の消化器症状も含まれている。
微小血管内皮細胞に発現
TMPRSS2は血管を構成する微小血管内皮細胞にも発現しているため、6 SARS-CoV-2によるウイルス感染は内皮機能障害を引き起こし、血栓症やそれに伴う合併症を引き起こす可能性がある。これらのデータは、臨床的に観察される重症患者の合併症におけるTMPRSS2の役割の根拠を示している。
疾患転帰のバイオマーカーとしてのTMPRSS2一塩基多型
乳がん
TMPRSS2の一塩基多型（SNP）に関する研究は、様々な疾患で実施されてくる。乳がんでは、rs2276205（A>G）のマイナー対立遺伝子が生存率の上昇と関連しており、これはタモキシフェンへの感作によるものと考えられている。13, 14 Rs2070788（G>A）とrs383510（T>C）は、重度のH1N1、H7N9、および肺におけるTMPRSS2の発現増加と関連していた。
東アジア集団のTMPRESS遺伝子
最近、イタリア人、ヨーロッパ人、東アジア人の間でTMPRSS2の遺伝子変異を比較したプレプリント研究では、イタリア人と東アジア人の間でrs12329760と2つの異なるeQTLハプロタイプの対立遺伝子頻度の違いが示された5。
興味深いことに、アジア人男性は前立腺がんの発生率と死亡率が低く、TMPRSS2:ERG融合遺伝子の頻度が低い。正確な感染率は、東アジア人が重症化しにくいことを示すかもしれない。
TMPRSS2阻害剤、薬剤併用の根拠、反応の臨床バイオマーカー
NF-κBK
TMPRSS2:ERG融合は、前立腺癌におけるToll様受容体-4およびNotch経路を含む核内因子-kB経路に関連する遺伝子をアップレギュレートすることができる18。
非前立腺組織におけるTMPRSS2およびTMPRSS2:ERG融合の役割については、この遺伝子がその後マクロファージにおけるNotchシグナル伝達カスケードを活性化し、Toll様受容体に関連した炎症反応や、腫瘍壊死因子α、インターロイキン（IL）-1β、IL-6などの炎症性サイトカインの放出を増大させるかどうかを含め、まだ解明されていない。
臨床的には、IL-6の増加は重度のCOVID-19症例21と関連しており、潜在的なバイオマーカーとして議論されている22。22 サイトカイン放出症候群（CRS）は、COVID-19の重症患者の一部に認められている23 。
炎症性マーカーの産生調節
同時に、TMPRSS2欠損マウスはSARS-CoV感染から保護され、サイトカインやケモカインの発現レベルが低下していることから、TMPRSS2がこれらの炎症性マーカーの産生調節に関与している可能性が示唆されている24 。24
サイトカインストーム
さらに、COVID-19患者の剖検所見では、SARS-CoV-2によって破壊された組織は、いわゆる一次サイトカインストーム（ウイルス感染によって誘導され、主に肺胞マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞によって産生される）の特徴を示したが、二次サイトカインストーム（ウイルス感染後期の活性化されたTリンパ球の異なるサブセットによって誘導される、あるいはT細胞賦活療法の合併症として誘導される）の特徴を示すことが明らかになった。 25
内皮機能障害
TMPRSS2ノックアウトマウスのデータと合わせて、TMPRSS2が一次感染部位でのウイルスの拡散および免疫病理に寄与していることを明らかにしており、その証拠はさらに、多くの症例で観察される血栓形成につながる内皮機能障害が関与している可能性のある基礎的なメカニズムを示唆している。
未解明のTMPRESSの生理的役割
さらに、TMPRSS2の生理的な役割は不明であり、ンドロゲン/アンドロゲンシグナル伝達や他の性ステロイドが、活発な感染時にTMPRSS2の発現を調節したり、免疫応答に関与する遺伝子を制御する別のETSファミリーメンバーとの新規融合の可能性を促進する役割を果たしているかどうかはまだ解明されていない。
我々の研究室や他の研究室では、抗アンドロゲン（例えば、エンザルタミド、アパルタミド）が前立腺癌細胞におけるTMPRSS2の発現を減少させることができることを実証している26, 27。
イタリアにおけるCOVID-19重症度の性差と国差の候補としてのACE2とTMPRSS2の変異と発現
www.aging-us.com/article/103415/text
まず第一に、我々はウイルス感染における重要な役割と、それらが性特異的な効果を媒介する可能性があるという先験的確率に基づいて同定された 2 つの候補遺伝子にのみ注目した。他の多くのX-linked遺伝子（IL13、IL4、IL-10、XIST、TLR7、FOXP3など）やY-linked遺伝子（SRY、SOX9）が性特異的な免疫応答の根底にあるかもしれない[31]。
さらに、性に偏った重症度と症例死亡率の非遺伝的決定要因は膨大であり、おそらく自然免疫応答と適応免疫応答の両方における性差[7]だけでなく、異なる国における性別や文化的習慣も関係していると考えられる。特に、ジェンダーに関連した重要な要因としては、女性の社会的役割（仕事、母性、育児の役割）、喫煙傾向、手指衛生の遵守、そして各国における女性の社会的役割の影響の違いなどが考えられる。
結論として、COVID-19の重症度に影響を与える可能性のある遺伝的要素について、イタリアの集団におけるACE2およびTMPRSS2遺伝子を媒介とする影響に焦点を当てて検討した。利用可能なデータから、ACE2レベルの性差が重症度の性差を説明できるとは考えにくい。しかし、肺における ACE2 レベルの変化が SARS-CoV-2 感染の感受性および重症度と相関しているかどうかを評価する必要がある。疾患症状の異なる患者を対象とした実験データが早急に必要である。
解析した仮説の中で、最も興味深いシグナルは、TMPRSS2発現の性差とTMPRSS2の遺伝的変異に関連していた。特に、東アジア人とイタリア人の間で、エクソン変異体（p.Val160Met）と2つの異なるハプロタイプを同定した。
これらのハプロタイプのまれな対立遺伝子は、すべてTMPRSS2の高レベル化を引き起こすと予測され、イタリア人では東アジア人よりも頻度が高くなっている；一方では、ハプロタイプがアンドロゲンによって制御されている可能性があり、COVID-19の重症度の性差を説明する可能性がある。
我々のデータは、イタリア人の致死率が既知のデータに比べて異常に高いことの説明を示唆するだけでなく、イタリア人の一般的な集団における候補変異体の参照頻度を示しており、これらのデータは、多くの患者の遺伝子データが入手できるようになり次第、異なる疾患症状を持つSARS-CoV-2に感染した患者の遺伝子データと比較することができる。これらの研究は、個人の感染リスクとCoV-2に対する感受性を予測し、予後不良のリスクが高い感染者を事前に認識するのに役立つことが期待される。
TMPRESS2阻害剤
ブロムヘキシン TMPRSS2阻害剤
Covid19が男性優勢であると考えられる理由は、アンドロゲンによって駆動される病原体であることと関係するかもしれない。
SARS-COV2、コロナウイルススパイクタンパク質は、膜貫通型セリンプロテアーゼ2（TMPRSS2）によるタンパク質分解活性化を受け、SARS-COV-2がACE2受容体を利用して細胞内に侵入することを可能にしている。
TMPRSS2は、主に前立腺上皮、高悪性度前立腺癌で高度に発現しており、アンドロゲンによって制御されている。思春期前の若者にCovid19の症例が少ないのは、TMPRSS2細胞表面プロテアーゼを活性化するためのアンドロゲンを持っていないからかもしれない。
Covid19は、他のグループよりも男性、喫煙者および高齢者に影響を与えている。喫煙はエストロゲンに対するアンドロゲンの比率を増加させるようで、これがTMPRSS2細胞表面プロテアーゼをプライムする可能性がある。
前立腺肥大症が高齢者に多いことも、TMPRSS2の増加に寄与している可能性があり、高齢者ではウイルス感染症の重症度が高くなっている可能性がある。アンドロゲンを阻害することは、COVID-19ウイルスを制御するための別のアプローチとなる可能性がある。
TMPRSS2の阻害薬には、ブロモヘキシン、カモスタットなどがある。TMPRSS2はまた、H1N1およびH3N2インフルエンザAウイルスのウイルス拡散に必要な宿主細胞因子でもあり、パンデミックインフルエンザAでは男性優位が観察されていることから、他のパンデミックウイルスでも同様の現象が起こる可能性があることを示唆する。
タイプⅡ膜貫通セリンプロテアーゼ 天然物の仮想スクリーニング
www.mdpi.com/1420-3049/25/10/2271/htm
ゲニポシド
これらの薬物様化合物の中で、化合物1（NPC306344）が最も高いドッキングスコア（-14.69）を示した。化合物1は、図4に示すように、受容体タンパク質の活性部位残基と10個の水素結合を形成している。これらの水素結合のうち、6つの残基（Asn146、Arg147、Arg150、Lys449、Asn450）は側鎖アクセプターであり、2つの残基（Asn146、Arg147）は背骨アクセプターとドナーの両方である。
この化合物は、IUPAC名メチル（1S,4aS,7aS）-7-（ヒドロキシメチル）-1-[3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]オキシ-1,4a,5,7a-テトラヒドロシクロペンタ[c]ピラン-4-カルボキシレート、通称ゲニポシドを有しており、クチナシ果実の主要なイリドイド配糖体の一つである。
これまでに、5-リポキシゲナーゼ[33]と腫瘍促進因子P-糖タンパク質[34]を阻害し、抗血管新生活性[35]と潜在的な抗喘息特性[36]を持つことが示されている。
さらに、ゲニポシドは、AMPKαを活性化して心筋の活性酸素種（ROS）蓄積を抑制することにより、敗血症誘発性心筋機能障害から保護することが最近明らかになった[37]。
ティノスポラ
ゲニポシドは様々な科、特にルビア科に属する40種近くの種に含まれており、中でも代表的なものは、Tinospora capillipes（中国原産）、Paederia scandens/ヘクソカズラ（中国原産）、Cornus officinalis/ サンシュユ（中国、日本、韓国原産）、Eucommia ulmoides（中国原産）、Lantana camara/ランタナ（メキシコ、中米、カリブ海、熱帯南米原産の雑草）などである。
Paratinospora sagittata（台湾南部と中国本土の分岐点に存在する）、アルテミシア・カピラリ（中国の薬草）、Plantago asiatica（中国、日本、韓国に自生）、Rehmannia glutinosa（中国に自生）、Plantago depressa（中国、韓国、ヒマラヤに自生）、およびクチナシ科のジャスミノイデス（ベトナム、中国南部、韓国、台湾、日本、ミャンマー、インド、バングラデシュに自生）。ADMET指標から、本化合物は消化管吸収能を持たず、血液脳関門を通過できないことが示唆された。
代謝的役割については，CYP450 3A4酵素の基質，OATP1B1の阻害剤であり，エストロゲンおよびアンドロゲン受容体，アロマターゼ結合能を有していることが明らかになった。
眼刺激性、エイムス毒性、発がん性はヌルであったが、ミツバチ、魚類に対する毒性は高かった。急性経口毒性は3.466kg/molであり，血漿蛋白結合率は50％程度であり，水溶性は低いようであった。
ラット急性毒性のLD50（致死量、50％）は2.79 mol/kg、Tetrahymena pyriformisのpIGC50（毒性予測値）は0.2 μg/L、魚類のpLC50（毒性予測値）は1.09 mg/Lであった。ミトコンドリアに局在すると予測され，生分解性は無視できるか，低いと考えられた。
海洋天然物
TMPRSS2の潜在的な阻害剤である他の上位にランクされた薬物様化合物[32]は、海洋天然物のエクスバトリドM（化合物2）、ブリアラン型のジテルペン、毒性があると予測されるセムラノリドのデュルモリドK（化合物6）、Shisandra sphenantheraからのジベンジルシクロオクタジエンリグナンのシスフェニンA（化合物3）などであった。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム、およびカンジダ・アルビカンスに対して抗菌活性を有する、
緑藻類のDictyosphaeria versluyiiから得られた真菌のデカラクトン・ジクチホスファ酸A（化合物4）[38]。化合物4）、
シチコリン
シチコリンとして知られる内因性シチジン（5′）-ジホスホコリン（化合物5）、一過性の大脳虚血および局所脳虚血において有益な効果を有する［39］
シルマリンに類似したベルベリス種のフラボノリグナンであり、NorAポンプ（血漿膜中のS．aureus in the plasma membrane [40]）、
サルガッサムとして知られる浮遊性藻類からの化合物8、野生のキノコPaxillusからのp-terphenyl抗酸化剤Curtisian L（化合物9）、microcarpin（化合物10）。
アロマターゼ阻害剤
また、主にArtocarpus属とBroussonetia属からのアロマターゼ阻害剤であるイソゲミハルコンB（化合物12）、
EGCG
緑茶ポリフェノール（-）-エピカテキン3-O-(3′-O-メチル)ガレート（EGCG3 「Me）（化合物11）、およびアロマターゼ阻害剤であるイソゲミハルコンB（化合物12）などが挙げられる。
アーユルベーダ
標準的な薬剤阻害剤と同等のドッキングスコアを有する残りの73の化合物のうち、アーユルヴェーダの伝統医学で使用されている人気のあるハーブの活性原理や、多成分の食品サプリメント製剤の成分、
Garcinia spp.からのフスカキサントンA（29、ドッキングスコア：-12.35）、ジャワ茶（Orthosiphon stamineus）からのオルソシフォノンD（44、ドッキングスコア：-12.00）、7-ヒドロキシ-14-デオキシwithanolide U（77、
アシュワガンダ
ドッキングスコア：-11。 12）からのWithania somnifera、一般的にアシュワガンダとして知られている、家族ソラマメ科に属する広大な薬効の植物[41]、およびOcimum basilicumおよびOcimum sanctum[42]からの6S,9R-roseoside（78、ドッキングスコア：-11.12）。
ホモロジーモデリング、バーチャルスクリーニング、分子動力学シミュレーションによる潜在的な抗TMPRSS2天然物の同定
Identification of potential anti-TMPRSS2 natural products through homology modelling, virtual screening and molecular dynamics simulation studies
www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/07391102.2020.1798813
要約
最近の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）の発生により、COVID-19のパンデミックが発生している。治療薬とワクチンがないことで、世界的に深刻な生命と経済の損失をもたらしている。SARS-CoVおよびSARS-CoV-2は、宿主細胞へのウイルスの侵入のためのスパイク（S）タンパク質のプライミングのために、宿主細胞セリンプロテアーゼTMPRSS2を採用する。SARS-CoV-2感染の初期部位を減少させる潜在的な方法は、TMPRSS2の活性を阻害することであるかもしれない。本研究では、TMPRSS2の3次元構造をホモロジーモデリングによって生成し、その後、多くのパラメータを用いて検証した。Selleckchemデータベースの構造ベースのバーチャルスクリーニングは、’Virtual Work Flow’（VSW）を介して行われ、潜在的な鉛様TMPRSS2阻害剤を見出すことができた。カモスタットとブロムヘキシンはTMPRSS2阻害剤として知られているため、研究全体を通してこれらをコントロール分子として使用した。
コントロール分子と比較して、より優れたドックスコア、結合自由エネルギー、および結合相互作用に基づいて、6つの分子（Neohesperidin、Myricitrin、Quercitrin、Naringin、Icariin、およびAmbroxol）がTMPRSS2に対して有望であることが判明した。
結合相互作用解析の結果、TMPRSS2の結合部位アミノ残基との間に有意な結合相互作用が多数存在することが明らかになった。全原子分子動力学(MD)シミュレーションの結果、提案されたすべての分子が動的な状態で受容体内部に保持されていることが示された。また、分子動力学シミュレーションの軌道から計算された結合エネルギーは、分子のTMPRSS2に対する強い親和性を支持するものであった。提案された分子は、バイオフラボノイドクラスのファイトケミカルに属し、抗ウイルス活性を有することが報告されており、本研究はCOVID-19への応用の可能性を示している。
天然物は鉛様化合物として進化的に最適化されており、現在に至るまで、幅広い疾患の治療薬の最大の供給源となっている（Newman & Cragg, 2012）。アーユルヴェーダおよび漢方薬（TCM）は、様々な慢性疾患および感染症の治療に使用されてきた（Dobos & Tao, 2011; Mathpati et al 2020）。天然物のこのような広範な可能性は、COVID-19における治療応用のための可能性のあるTMPRSS2阻害剤を見出すために利用することができる。この可能性を探索するために、我々は、TMPRSS2のホモロジーモデルに対する天然物データベースのスクリーニングを行うことを計画した。さらに、分子ドッキングに基づく結合エネルギーと長期的古典分子動力学（MD）シミュレーションにより、化学空間を縮小した。最後に、結合自由エネルギーは、最終的な植物性化合物を決定するために、分子力学-一般化ボルン表面積（MM-GBSA）アプローチを介して計算される（Genheden & Ryde, 2015）。本研究の信憑性は、TMPRSS2阻害剤として5つの有望な植物性化合物の発見によって実証された。
結果と考察
ウイルス感染における宿主プロテアーゼを標的とすることは、抵抗性の出現を克服する可能性のある抗ウイルス薬を開発するための比較的新しい戦略である。パンデミックの脅威への迅速な対応を可能にするためには、病原性コロナウイルスおよび他の新興ウイルスに対する有効な抗ウイルス薬が望まれている。
TMPRSS2は、タンパク質分解活性化およびその結果としてのコロナウイルスの拡散および病原性に必須であることが示されている宿主因子の1つである。SARS-CoV-2のウイルス侵入におけるACE-2との結合における重要な役割を考慮すると、これらのウイルス感染症の治療のための有望な薬物標的である。
この研究からの最終的な化合物は、バイオフラボノイドとしても知られているフラボノイドのクラスに属している。バイオフラボノイドは、古来よりアーユルヴェーダや中国伝統医学（TCM）で感染症や非感染症の治療に用いられてきた食品やハーブに多く含まれている。
本研究はまた、緑の野菜やハーブ、果物などの栄養価の高い食品が、これらのファイトケミカルの存在により、COVID-19と戦うための免疫力の向上に役立つことを示している。
おわりに
天然物からいくつかの重要なCOVID-19治療薬を同定するために、ホモロジーモデリングに基づいたファーマコインフォマティクスアプローチをTMPRSS2に適用した。TMPRSS2の結晶構造が入手できなかったため、ホモロジーモデリングによって得られた3次元座標を、天然物の広範なバーチャルスクリーニングによって生成することにした。
天然物データベースは3段階の分子ドッキングでスクリーニングされ、最終的に10種類の天然物と5種類の標準的な医薬品分子の分子動力学シミュレーションが行われた。これら15の分子の自由エネルギー計算が行われ、さらに解析が行われた。
トップ5の天然物であるNeohesperidin、Myricitrin、Quercitrin、Naringin、Icariin、および2つの治療薬であるCamostat、Ambroxolについて詳細に議論した。MM-GBSA法を用いて分子ドッキング、MDシミュレーション、結合自由エネルギーを算出したところ、すべての化合物がTMPRSS2に対して強い親和性を持っていることがわかった。
これらの天然化合物はバイオフラボノイド類に属する植物化学物質であり、その中でもネオヘスペリジン、ミリシトリン、ケルシトリンの3つの化合物は抗ウイルス活性を有することが知られている。
本研究は、これらの化合物の抗ウイルス活性の作用機序を明らかにするものであり、これまでの報告を裏付けるものである。また、TMPRSS2を阻害することにより、SAR-CoV-2ウイルスのヒト宿主細胞への侵入が抑制されることが示唆された。以上のことから、ファーマコインフォマティクスを駆使して提案された化合物は、実験的な検証を経て、COVID-19の管理を成功させるための重要な生体分子であると結論づけられる。
カテプシンL/カテプシンプロテアーゼ阻害剤
www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300908420301280
一方、ヒト細胞プロテアーゼであるカテプシンLとTMPRSSがウイルスの細胞内への侵入に不可欠であることはよく知られている。グリコペプチド抗生物質であるテイコプラニンによるカテプシンLの阻害は、宿主細胞へのSARSコロナ偽型ウイルスの侵入をブロックすることが示されている[42,43]。
Zhangらによる最近の研究では、teicoplaninが試験管内試験（in vitro）でSARS-CoV-2の細胞内への侵入を抑制できることが示された[44]。また、オキソカルバゼート剤によるカテプシンLの抑制は、ヒト細胞におけるSARS-CoVおよびエボラ偽型ウイルスの侵入をブロックすることが主張されている[45]。
チオカルバザート
注目すべきは、Ouらによるごく最近の研究で、ヒトACE2を発現するHEK293細胞を、ヒトカテプシンLの強力かつ選択的な阻害剤であり、以前に試験管内試験（in vitro）でマラリア寄生原虫Plasmodium falciparumおよびLeishmania majorの伝播を阻害することが示されていたチオカルバザートSID26681509（図3）で処理すると、細胞内へのSARS-CoV-2（S）疑似ウイルスの侵入が著しく減少することが報告されている[46]。
また、SID 26681509は、100μMでの生体アッセイにおいて、ヒト大動脈内皮細胞およびゼブラフィッシュに対して無毒性であることが報告されている[43]。同様に、TMPRSS2もまた、(S)糖タンパク質のプライミングに必要であり、SARSウイルスの侵入に不可欠である。実際、非常に最近の研究で、Hoffmannと共同研究者らは、SARS-CoV-2が（S）糖タンパク質のプライミングのためにTMPRSS2プロテアーゼをハイジャックすることができることを示した。
まとめると、SRAS-CoV-2糖タンパク質の活性化に関与するプロテアーゼ、特にカテプシンLおよびTMPRSS2プロテアーゼを標的とすることは、SRAS-CoV-2感染症の潜在的な治療法である可能性がある。
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