COVID-19 Nrf2

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Nrf2アクチベーターPB125によるCOVID-19に対する治療薬としての可能性

www.mdpi.com/2076-3921/9/6/518/htm

要旨

Nrf2は、細胞内の酸化還元バランスを調節し、抗ウイルス作用を含む免疫や炎症に関わる様々な遺伝子の発現を制御する転写因子である。Nrf2活性は加齢とともに低下し、高齢者では2型糖尿病、慢性炎症、ウイルス感染症などの酸化ストレスが関与する疾患にかかりやすくなる。

これまでに発表されたエビデンスでは、Nrf2活性がウイルスの感受性や複製に影響を与える重要なメカニズムを制御している可能性が示唆されている。我々は、GeneChipマイクロアレイおよびRNA-seqアッセイを用いて遺伝子発現レベルを調べた。

その結果、Nrf2 活性化組成物 PB125®がヒト肝由来 HepG2 細胞において、ACE2 および TMPRSS2 の mRNA 発現を抑制することが明らかになった。ACE2は表面受容体であり、TMPRSS2はSARS-CoV-2が宿主細胞に侵入するためのスパイクタンパク質を活性化する。

さらに、エンドトキシン刺激を受けたヒト初代肺動脈内皮細胞において、サイトカインをコードする36の遺伝子のうち、PB125による顕著なダウンレギュレーションが報告されている。これらには、IL-1-β、IL-6、TNF-α、細胞接着分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、およびIFN-γ誘導遺伝子群が含まれる。これらのサイトカインの多くは、COVID-19の致死的な症例で観察される 「サイトカインストーム 」に特異的に同定されており、Nrf2の活性化が嵐の強度を有意に減少させる可能性を示唆している。

1. 序論

Nrf2 は、ヒトでは NFE2L2 遺伝子によってコードされている転写因子である。Nrf2は、「細胞の酸化還元恒常性のマスターレギュレーター」[1]と呼ばれ、「健康寿命の守護者」「種の長寿のゲートキーパー」[2]とも呼ばれている。

Nrf2は、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、多数のペルオキシダーゼ、グルタチオン代謝など、酸化ストレスから私たちを守る遺伝子のほとんどを制御しており、重要な代謝経路に関与する数百もの遺伝子を含む[3]。

活性酸素種(ROS)による損傷や不活性化に対する様々な構造的および触媒的遺伝子産物の個々の脆弱性は、変性疾患や代謝機能障害につながる可能性がある。

重要なことに、Nrf2は加齢とともに減少し[4,5]、老化に伴う「虚弱性」に大きく寄与している[6,7,8]。Nrf2は酸化ストレスと闘う遺伝子を転写的にアップレギュレーションするため、Nrf2の喪失により酸化ストレスが抑制されず、老化表現型を促進することになる [1,8,9]。

酸化ストレスは、それゆえに、総称して「老化の特徴」と呼ばれる老化プロセスに関連する主要な特徴の中で共通のテーマであり、タンパク質の恒常性[10]を破壊し、ゲノムの安定性[11]を変化させ、ウイルスや微生物感染[12]に対する感受性を変化させ、細胞死を引き起こする。これは、現在私たちが直面しているコロナウイルスのパンデミック[13]のような状況において、最も脆弱な集団を定義しているのは、この年齢に関連した脆弱性[8]である。

数多くの発表された研究では、Nrf2が呼吸器ウイルス感染症に対する感受性の調節因子であることが示唆されている。Leeによる最近のレビュー[14]では、宿主の抗酸化反応のウイルス誘発性調節が、いくつかのウイルス性疾患の進行に重要な決定因子であることが明らかになったと指摘している。

ウイルスは、ウイルスの代謝をサポートするために、ウイルスの繁殖に最適なレベルの酸化ストレスを、通常よりも高いレベルに保つ必要があるが、宿主細胞を死滅させるほど高くすべきではない。ウイルスは、ウイルスのニーズに応じて、両方向にNrf2経路を操作するメカニズムを進化させてきたが、重要なのは宿主細胞から制御を奪うことである。

研究されているウイルスの種類としては、インフルエンザウイルス、呼吸器同期ウイルス(RSV)、ヒトメタニューモウイルス(hMPV)などがある[12,15,16,17,18]。

この現象は、デングウイルス(DENV)[19]、ロタウイルス[20]、単純ヘルペスウイルス[21]、ジカウイルス[22]、およびHIV[23]を含む非呼吸器系ウイルスにも見られ、酸化ストレスの調節は、すべてではないにせよ、ほとんどのウイルスに共通のニーズである可能性があり、Nrf2活性化剤は、抵抗性を高め、ウイルスの複製を遅らせるための重要な経路の制御を取り戻すための複数の方法を提供する可能性があることを示唆している。

我々は最近、特にAkt1/PI3K/GSK3β/Fyn経路を介して、プロセスに関与する複数のステップを制御することにより、Nrf2を強力に活性化するファイトケミカル組成物であるPB125を記述した[24]。

本研究の目的は、PB125を介したNrf2活性化のヒト肝臓由来HepG2細胞および培養中の初代ヒト肺動脈内皮細胞(HPAECs)への影響を評価することであった。内皮細胞は、最近、COVID-19によって引き起こされる組織破壊の主要なプレーヤーとして暗示されている。

VargaらはCOVID-19患者の死後分析を行い、複数の臓器の血管床全体に内皮細胞が関与していることを見いだし、その中には腎内皮細胞におけるウイルス粒子の電子顕微鏡的証拠も含まれている。Ackermannらもまた、細胞内にウイルス粒子が存在することを記録している。

さらに、彼らは、COVID-19患者の肺には、構造的に変形した毛細血管を持つ歪んだ血管性があり、直径が急激に変化していることや、血管新生が大幅に調節されていないことが原因であると考えられる咬合性の柱が存在していることを発見した[26]。これらの知見は、COVID-19の焦点を肺上皮の疾患から多臓器血管内皮の疾患へと広げるものである。

そこで我々は、一般的に抗ウイルス活性に重要であることが知られている遺伝子の発現を測定し、また、ACE2やTMPRSS2のようなCOVID-19に特異的に関連する遺伝子の発現を測定した。

サイトカインシグナル伝達の調節因子として新たに認識されたプラスミノーゲン(PLG)[29]、および最近、インフルエンザAウイルスの成熟および拡散に関与する宿主プロテアーゼ(TMPRSS2を含む)の阻害において重要な役割を果たすことが示されている組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター(PAI-1)(SERPINE1)[30]。

さらに、内皮細胞によって発現される36種類のサイトカインのグループが有意にダウンレギュレートされていたことから、PB125は、サイトカイン放出症候群として知られるサイトカインの過剰な産生、または移植片対宿主病[31]、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、およびCOVID-19[32]を含む少数の炎症性疾患を特徴づける「サイトカインストーム」として知られるサイトカインの過剰な産生を減衰させるのに有用である可能性があることが示唆されている。

4. 考察

過去10年間で、Nrf2とそのレドックス恒常性、炎症と免疫、神経変性、加齢とそれに伴う疾患、虚血再灌流傷害、その他多くの分野での関与について1万件以上の論文が発表されているが、ウイルス感染性と抵抗性におけるNrf2の役割については、いくつかの興味深い研究があるにもかかわらず、比較的ほとんど発表されなかった。

Kesicらは、ヒト鼻上皮細胞におけるNrf2発現のsiRNAノックダウンにより、これらの細胞におけるNrf2 mRNAおよびNrf2タンパク質発現の両方が効果的に低下することを示しており、これはインフルエンザA/Bangkok/1/79(H3N2血清型)の侵入および導入されたヒト細胞における複製の有意な増加と相関することを示した[12]。

重要なことは、スルフォラファン(SFN)やエピガロカテキンガレート(EGCG)を添加してNrf2の活性化を高めることで、ウイルス感染がない場合に抗ウイルスメディエーターが増加し、ウイルスの侵入も抑制されることを示したことである。

Yegetaらは、Nrf2の発現を遺伝的に操作するだけでなく、外因性の酸化ストレスであるタバコの煙にマウスを曝露することで酸化ストレスを増加させた[15]。タバコの煙にさらされたNrf2欠損マウスは、インフルエンザウイルス感染後に野生型マウスよりも高い死亡率を示し、肺周囲の炎症、肺透過性障害、粘液の過分泌が亢進していた。

Choら[40]は、小児の急性呼吸器感染症の原因となる最も重要なウイルスである呼吸器合胞性ウイルス(RSV)感染についても同様に研究している。彼らは、RSVに感染したNrf2-/-マウスは、同様に感染したNrf2+/+ WTマウスと比較して、気管支肺の炎症、上皮傷害、粘液細胞の転形成、および鼻上皮傷害が有意に増加していることを発見した。

Nrf2-/-マウスはまた、ウイルスクリアランスおよびIFN-γの有意な減少、およびより大きな体重減少を示した。重要なことに、経口スルフォラファンによる前処理は、Nrf2+/+ WTマウスの肺RSV複製およびウイルス誘発性炎症を有意に制限した。

Komaravelliら[16,17,18]は、RSVは活性酸素の産生を増加させるだけでなく、Nrf2のプロテアソーム分解速度を増加させることにより、抗酸化酵素の発現を積極的に低下させることを指摘している。感染後6時間では、Nrf2依存性の遺伝子転写が増加しており、細胞が制御され、ウイルス感染の侮辱と酸化ストレスの増加に応答していることを示している。

しかし、感染後15時間までにはNrf2濃度は感染前の半分程度にまで低下しており、ウイルスに有利な制御状態に変化していた。これを達成するために、RSVはNrf2のユビキチン化を増加させ、そのプロテアソーム分解を誘発した。

これらの研究をまとめると、Nrf2がウイルスの侵入を阻害し、ウイルスの複製を遅らせ、炎症、体重減少、死亡率を低下させる能力があることがわかるが、どの遺伝子や経路が関与しているのかについての詳細な知見は得られてわない。

ウイルス、特にある宿主種から別の宿主種にジャンプするウイルスが直面する最初の課題は、細胞への侵入である。エンドソームへの侵入につながるLDLRやICAM1などのかなり一般的な侵入口があり、これらは様々なウイルスファミリー間で共有されている[41]。

しかし、SARS-CoV-2は、完全ではないにせよ、ほとんどが非常に特異的な侵入経路に限定されているように思われる。この特異的な侵入様式がウイルスの最大の脆弱性であり、有効な治療法への扉を開いている可能性がある。

大幅な証拠は、TMPRSS2遺伝子によってコードされる膜貫通型プロテアーゼが、SARSおよびMERSコロナウイルス、2013年アジアH7N9インフルエンザウイルス、およびいくつかのH1N1亜型インフルエンザAウイルス感染症の侵入において重要な役割を果たしていることを示唆している[27,42,43,44,45]、TMPRSS2を標的とすることがコロナウイルスを治療するための新規抗ウイルス戦略であり得ることを示唆している[42]。

Hoffmannらは、COVID-19の原因ウイルスであるSARS-CoV-2による感染が、ほぼ独占的に宿主細胞因子ACE2およびTMPRSS2に依存している可能性があることを発見した[27]。コロナウイルスのスパイク(S)タンパク質は、標的細胞へのウイルスの侵入を促進する。

侵入は、標的細胞の表面へのウイルスの付着を促進する細胞受容体ACE2へのSタンパク質の結合に依存する。さらに、侵入には、細胞プロテアーゼTMPRSS2によるSタンパク質の「プライミング」が必要であり、これはSタンパク質の切断を伴い、ウイルス膜と細胞膜の融合を可能にする(図4)。

このプライミングは、臨床的に証明されているTMPRSS2のプロテアーゼ阻害剤、メシル酸カモスタット[27,46]およびメシル酸ナファモスタット[47]によってブロックすることができる。

Nafamostatは、試験管内試験(in vitro)でMERS-CoVの細胞侵入をブロックするためのIC50がナノモルの範囲内であり、非常に強力であるが、ヒトでの抗ウイルス薬として臨床試験は行われていない。この薬は現在のところ経口剤形では入手できないようであり、特異性がないため、副作用の可能性が懸念されている[47]。重度のCOVID-19症例の治療に適している可能性がある。

図4. SARS-CoV-2の複製サイクル。

酸化防止剤09 00518 g004 550

細胞膜へのウイルスの結合(1)は、ACE2受容体を介して起こる。その後、スパイクタンパク質は細胞内への侵入を可能にするために切断されなければならない(セリンプロテアーゼTMPRSS2を表すハサミとして示されている)(2)。

活性化されたスパイクタンパク質は細胞膜を貫通し(3)、ウイルスゲノムの侵入を可能にし(4)、複製、翻訳、および成熟したウイルス粒子への組み立てが行われる(5)。

左側には、抗ウイルス薬のカモスタットとナファモスタット、およびSERPINE1遺伝子によってコードされるプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤PAI-1によるTMPRSS2阻害が示されている。PB125はPAI-2をアップレギュレートし、HepG2細胞ではTMPRSS2とACE2の両方をダウンレギュレートする。

TMPRSS2は、図4に示すように、ヒト抗プロテアーゼプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1(PAI-1)[34]によってもブロックすることができる。

Iwata-Yoshikawaら[43]は、TMPRSS2をノックアウトすると、SARS-CoVに感染したマウスの気管支および/または肺胞の病理および免疫病理の両方が改善され、体重減少が完全に防止されることを発見した。このことは、SARS-CoV-2の場合のように、TMPRSS2が唯一の侵入機構ではないSARS-CoV感染において特に注目すべきことである。

したがって、PB125はACE2を-3.5倍、TMPRSS2を-2.8倍、強力なTMPRSS2阻害剤であるPAI-1を17.8倍もダウンレギュレートしたという我々のデータが示されている(図2)。

8倍(図2)は、PB125処理により、細胞表面上のACE2およびTMPRSS2が減少し、血漿PAI-1が17.8倍増加した結果、残りのTMPRSS2を阻害するであろう血漿PAI-1が17.8倍増加した結果、SARS-CoV-2が宿主細胞に結合し、スパイクタンパク質の活性化を得る能力が低下する可能性があることを強く示唆している。

 

Dittmannら[30]は、インフルエンザAウイルス(IAV)の感染は、ウイルスの阻害-PAI-1の産生増加に必要かつ十分な宿主応答を誘発することを発見した。彼らは、IAVの場合、宿主プロテアーゼ(プラスミンまたはTMPRSS2など)によるウイルスコートタンパク質ヘマグルチニンのタンパク質分解的切断が、子孫粒子の成熟および感染のための要件であることを発見した。組換えPAIをHAECの先端側に添加すると、キャリアコントロールと比較してIAVの増殖が有意に減少し、感染後48時間の時点で感染性が約90%阻害された。

対照的に、α-PAI-1 抗体の添加は、IAV の増殖を劇的に促進した。このように、多くのウイルスは、様々な侵入・成熟機能を宿主のエンドプロテアーゼとエキソプロテアーゼの両方に依存していることがわかった。さらに、SARS-CoV-2感染に必要なTMPRSS2が、PAI-1によって効果的に阻害されるトリプシン様プロテアーゼの一つであることを発見した[30]。

Kumarらによる最近の論文[48]では、アーユルヴェーダ植物Ashwagandha(Withania somnifera)の抽出物に含まれるウィットに富んだハフェリンAとウィザノンがTMPRSS2の触媒部位で安定的に相互作用し、医薬品の阻害剤であるカモスタットメシル酸塩を模倣していることをコンピュータモデルを用いて予測している[27,46,48]。

さらに、Kumarらは、withanoneがTMPRSS2遺伝子をダウンレギュレートすることを発見したが、PB125を用いてここで報告したものと同様に、TMPRSS2遺伝子をダウンレギュレートした(図2)。アシュワガンダはPB125の3つの成分の1つであるため、PB125はTMPRSS2の酵素活性を阻害するだけでなく、そのmRNAの発現をダウンレギュレートする可能性がある。

ウイルスの侵入機構への直接的な関与とは別に、PB125はヒト肝臓由来のHepG2細胞においてHDAC5を-2.8倍もダウンレギュレーションしている(図2にも示されている)。Nrf2のアセチル化は、標的遺伝子プロモーター内でのNrf2とそのコグネート応答エレメントとの結合を増加させ、標的遺伝子のNrf2依存性の転写を増加させる[49]。

ヒトでは、HDAC5は、Nrf2活性の脱アセチル化および減衰に関与するアイソザイムであると考えられており[28]、Komaravelliら[18]が上述したRSV感染によってアップレギュレートされた遺伝子である可能性が高い。このように、PB125は、Nrf2の脱アセチル化およびその後の分解を阻害することにより、核内でより活性なアセチル化Nrf2をより長い時間維持し、ウイルスが細胞の酸化還元状態の制御を徴発しようとし、間接的に、すべてのNrf2依存性の作用を増幅することによって、上で列挙したメカニズムの1つを打ち消している。

サイトカインLIF、ウイルス感染に対する重要な抗ウイルス細胞応答のアップレギュレーションは、図2ではPB125によって強くアップレギュレーションされていることが示されており、それをダウンレギュレートしようとするウイルスによる潜在的な試みに再び対抗している。

LIF遺伝子の発現はH7N9感染によってダウンレギュレートされ、LIFのノックダウンは調査した3つのインフルエンザA株のウイルス力価を増加させ、ウイルス防御におけるLIFの重要な役割を示している[39]。

RSVに感染したLIFノックアウトマウスを用いて生体内試験(in vivo)試験を行った。LIFノックアウトマウスはコントロールマウスに比べて高いウイルス力価を示し、LIFシグナル伝達がRSV感染時の肺の傷害からの保護に重要であることが示された[38]。

TMPRSS2がSARS-CoV-2スパイク蛋白質を活性化するのを防ぐ上でのPAI-1の役割について述べたが、多くの人がその「本当の仕事」と考えるであろう、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)と組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)の両方によるプラスミノーゲン(PLG遺伝子によってコードされる)のプラスミンへの変換をブロックすることについても言及しておくべきであろう。

線維溶解はプラスミンの最初の機能として認識されていたので、PAI-1の高発現は静脈血栓症の危険因子であるかもしれない低レベルのプラスミンを引き起こすと予想される。しかしながら、遺伝的なプラスミノーゲン欠損は血栓症のリスクとは強く関連していない[50]。

PLG遺伝子にホモ接合性の変異があり、検出可能なプラスミンがほとんどまたは全く検出されなかった23人の被験者を対象とした研究では、96%が結膜の臨床的炎症(結膜炎)を有していたが、0%が静脈血栓症を経験していた[51]。しかし、サイトカイン放出に関するプラスミンの新たな役割が認められている [29,31,52,53,54]。

「サイトカインストーム症候群」は、重度の感染症などの様々な要因によって引き起こされる全身性炎症反応の一形態である。これは、大量の白血球が活性化されて炎症性サイトカインを放出し、その結果、さらに多くの白血球が活性化されるときに起こる。

Satoらは、急性移植片対宿主病のマウスモデルにおいて、プラスミンの薬理学的阻害が死亡率を有意に抑制することを発見し、プラスミン阻害が移植片対宿主病から生じる致命的なサイトカインストームを制御し、組織破壊を防止するための新しい治療戦略を提供しうることを提案した[31]。

マクロファージ活性化症候群(MAS)は、過剰な免疫活性化によるサイトカインストームと多臓器機能不全によって特徴づけられる生命を脅かす疾患である。MASのマウスモデルでは、島津らは致死率において同様の予防が見られ、プラスミンが炎症性細胞の流入と炎症性サイトカイン/ケモカインの産生を調節していると結論づけている[29]。

プラスミノーゲンはまた、アストロサイトの活性化に関与し、プロ炎症性サイトカインの配列を産生することが示唆されている[54]。図2では、PB125が肝臓細胞でプラスミノーゲンmRNAを-1.9倍ダウンレギュレートすることを報告している。

したがって、生体内では、プラスミノーゲンのダウンレギュレーションとPAI-1の17.8倍の増加(組織型およびウロキナーゼ型の両方のプラスミノーゲン活性化因子と共有結合的に反応して不活性化する)の組み合わせが、プラスミン誘発性サイトカインストーム現象を有意に減衰させるのではないかと推測している。

COVID-19における高炎症は、プロ炎症性サイトカイン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子-α(TNF)および多数のTNF誘導タンパク質、ならびに顆粒球コロニー刺激因子(GCSFまたはCSF3)のこのような上昇と関連している。

中国の武漢で入院した COVID-19 患者 41 人のうち,全員が IL-1B,IP10/CXCL10,MCP1/CCL2 の上昇を認めた.この患者のうち16人はその後ICUに入院し、GCSF/CSF3、IP10/CXCL10、MCP1/CCL2、MIP1A/CCL3、およびTNF-αの血漿レベルがさらに高く、サイトカインストームの強度は死亡率の強力な予後因子であった [55]。

これらのCOVID-19関連サイトカインをコードする遺伝子のすべてが、LPS処理したHPAECでは有意にアップレギュレートされ、PB125処理では有意にダウンレギュレートされたため、図3に示されている。重要なことに、サイトカインストーム症候群は、ほとんどのCOVID-19死亡例における死亡の直接の原因であると結論づけている研究が増えている[55,56,57,58]。

我々は、Nrf2発現の加齢に関連した損失が十分に文書化されていること[4,5]がサイトカインストームの発生に寄与する可能性があると推測している。COVID-19患者40人を対象とした縦断的研究[59]では、重症患者13人は軽症患者27人に比べて高齢(平均年齢59.7 vs 43.2)であり、C反応性蛋白質が有意に上昇し(平均62.9 vs 7.6mg/L)、2週間の観察期間を通して一貫して高い好中球数と低いリンパ球数を示していた。

これらの観察 [55,59] は、COVID-19感染の重症度の明確な傾向が、年齢および炎症反応の強さと直接関連しており、おそらくNrf2発現とは逆に関連していることを示している [8]。急性炎症反応の産生と自己増幅性は、炎症を起こした組織への好中球の自律的な吸引力を壊すために、宿主組織からの迅速な後続の「生存反応」を必要とする。

我々は、若い健康な個体ではNrf2の強力な酸化ストレス誘発性活性化が、集まってくる嵐に続いて、取り返しのつかない自傷行為による損傷から宿主組織を救うことを提案している。高齢者や慢性炎症を伴う併存疾患の存在下では、Nrf2活性化反応はイベントの自己永続的なサイクルを断ち切るには不十分であるかもしれない。

図5は、この提案された一連の事象を示している。

私たちは、高齢者や他の障害のある患者で利用可能な限られたNrf2のより多くの部分を活性化することで、若い患者と同様にサイトカイン産生を停止してエスカレートするサイトカインストームを止め、炎症エピソードの回復と修復の段階に入ることを提案している。

Nrf2の亜最適レベルへのこの活性化ブーストは、いくつかの薬理学的薬剤によって、また、ここでPB125を用いて示したように、多くの植物化学的活性化剤によっても、同様に、あるいはそれ以上に提供することができる。

図5. 急性炎症性イベントの発生と解決

酸化防止剤09 00518 g005 550

(1) 細菌やウイルスの感染により発症し、(2) 内皮細胞によるサイトカインの局所的な産生により、炎症性細胞を呼び寄せて侵入を中和させる。

(3) スーパーオキサイドや二次酸化物質が産生され、貪食が起こり、最初に反応した人がより多くのサイトカインを放出し、活性化された炎症細胞の後続の波を呼び込む攻撃が起こる。

(4) 若い健康な細胞では、戦闘によって発生した酸化ストレスがNrf2を活性化し、数時間以内に、近くの組織がさらなる組織サイトカイン産生を抑制し、宿主細胞をさらなる損傷から救い、(5)修復、クリーンアップ、および回復を可能にする。

あるいは、(4a)では、Nrf2を欠損した古い細胞は、Nrf2を十分に活性化して自律的連鎖反応を断ち切ることができず、その結果、最終的に宿主組織を破壊し、死に至る制御不能なサイトカインストームに陥ることがある。

古い細胞で利用可能な限られたNrf2のより強固な活性化は、薬理学的または植物化学的Nrf2活性化剤によって提供されるかもしれない。

COVID-19患者の縦断的研究[59]では、重症例(平均835.5μg/L、範囲635.4~1538.8)と軽症例(平均367.8μg/L、範囲174.7~522.0)との比較で、血清フェリチン濃度が著しく高かったことが報告されていることは注目に値する。

フェリチンは、炎症性条件下でスーパーオキシドラジカル[60,61,62,63]によって放出される鉄の供給源として長い間認識されてきた。サイトカインストームによって沈殿する強烈な酸化ストレスの下では、鉄の放出は、脂質過酸化を触媒し、宿主組織傷害を大幅に増幅するであろう。

COVID-19はすでに、既知の「高フェリチン血症」疾患の短いリストに追加されており、これらの疾患はすべて、高血清フェリチンと、最終的に多臓器不全をもたらすサイトカインストームによって持続する生命を脅かす高炎症によって特徴づけられる[64]。

フェロプトーシスは、鉄に依存し、ミトコンドリアの機能不全と毒性のある脂質過酸化によって細胞死を引き起こす調節された細胞死の新たに記述された形態である。Nrf2は「フェロプトーシスストレスの発症と結果を調節する重要な決定論的要素」として暗示されている[65]。

我々は、SARS-CoV-2に対する脆弱性に関与している可能性のある3つの異なる現象を研究したが、これらの相互作用現象は、どの単一の細胞型にもすべて存在するわけではない。最初の目的である、ACE2およびTMPRSS2の発現に対するPB125の効果を研究することは、肺胞II型細胞[27]およびHPAECs[25,26]を含む、推定されるポイントオブエントリー細胞で研究することができた。

ACE2とTMPRSS2を共発現する細胞型を含む多くの臓器(心臓、腸、腎臓、眼)にウイルスが侵入する可能性があることが臨床的にも実験室でも示唆されており、肝臓ではACE2とTMPRSS2の両方のダウンレギュレーションが認められた。このように、肝臓もまた、これらのエントリー遺伝子を研究するための関連する細胞である。

第二の目的は、PB125がPLGのダウンレギュレーションおよび/またはPAI-1のアップレギュレーションによって全身のプラスミン活性を制限できるかどうかを調べることであった。この場合、肝臓はプラスミノーゲンの供給源であり、調べるのに適切な細胞タイプである。血漿中のPAI-1の供給源は不明であるが、肝臓である可能性もあるし、筋肉である可能性もある。

PB125がサイトカインストーム現象に関与していると同定されたサイトカインをダウンレギュレートできるかどうかという第三の目的については、一次HPAECに焦点を当てるのが適切であると考えているが、より全体像を把握するためには炎症性細胞そのものの研究が必要である。

HPAECは、我々が調べた36種類のサイトカインを生成し、炎症性細胞を感染臓器に勧誘する全身的な警鐘を鳴らしている。II型肺胞細胞はサイトカインを産生する能力がほとんどない [66]。介入によってサイトカインストームを引き起こす炎症サイクルをどのようにして断ち切ることができるかを研究するためには、血管内皮細胞が単独で最も重要な役割を果たすと考えられる。

この研究の潜在的な限界は、炎症反応を誘導するSARS-CoV-2のサロゲートとしてLPSを使用していることである。

我々は、Nrf2経路の進化的な原動力の一つは、制御不能な炎症性イベントに対するフェイルセーフブレーキを提供することであったのではないかと提案する。

強烈な炎症部位での酸化ストレスの増加は、Nrf2を活性化するシステムのための意図したトリガーであった可能性があり、それは侵略者が打ち負かされた可能性が高いが、宿主が生き残ることができるかもしれないポイントで攻撃を終了することができる。

実際、Nrf2によって誘導される遺伝子群は、長い間「生存遺伝子」と呼ばれてきた[3]。

5. 結論

我々は、呼吸器ウイルスの感染性と抵抗性、または関連する免疫応答に関連する42の遺伝子群が、薬理学的なNrf2活性化に応答することを示した。

これらの複数の抗ウイルス効果の合計は、ある程度の抵抗性を与え、ウイルスの複製率を減衰させ、微小血管損傷を制限することによって症状を緩和し、おそらくCOVID-19で特に問題となっている「サイトカインストーム」をうまく通過することを可能にする可能性があるように思われる。

知恵の終わりのない進化戦争が続いていても、ウイルスは時折戦いに勝利するが、Nrf2によって制御される複雑で多面的な抗ウイルスメカニズムのこのシナリオは、私たちが保護され、機能的に維持する上で、この非常に中心的な転写因子の重要性を強調するのに役立つ。

Nrf2アクチベーター(DMF)とCOVID-19 役割の可能性はあるか?

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7296400/

要旨

はじめに

COVID-19は、肺や気道に影響を与え、患者の死に至る致死的な結果をもたらす新しいウイルス性疾患である。ACE2受容体は、肺、腎臓、小腸、心臓などの組織に広く障害されており、COVID-19ウイルスの標的とされている。

ウイルスのSタンパク質はACE2受容体に結合し、内因性の抗ウイルスメディエーターのダウンレギュレーション、NF-κB経路のアップレギュレーション、活性酸素、プロアポトーシスタンパク質のアップレギュレーションを引き起こした。

Nrf2 は抗酸化酵素の生成に関与する転写因子であることが明らかになった。

目的

COVID-19 陽性患者の治療における Nrf2 活性化因子の役割を明らかにし、その役割を確立する。

方法

本研究では、COVID-19の薬理学的な問題点や世界的なCOVID-19感染症との戦いに含まれる側面と関連したCOVID-19に関する研究を掲載した論文を分析する方法を用いて、Nrf2アクチベーターであるDMFをCOVID-19の臨床試験に使用することで、肺胞細胞の損傷を軽減する効果がどのように得られるのかを明らかにした。

結果

Nrf2 活性化剤は、SPLI 遺伝子の発現を誘導してウイルスの侵入を抑制するとともに、TRMPSS2 の発現を抑制することで、ウイルスとの結合部位で競合する ACE2 のアップレギュレーションを抑制することで、ウイルスの病原性を抑制する重要な薬剤であることが明らかになった。また、NF-κB経路を阻害し、アポトーシスタンパクやTLRの遺伝子発現を抑制する役割を果たしている。

以上のことから、本研究では、DMF を使用することで、アポトーシスを抑制することが可能であると結論づけた。

nCOVID-19 陽性患者の肺胞細胞損傷を軽減するために、DMF(Nrf2 活性化剤)を臨床試験で使用することが有効であると結論づけた。

はじめに

コロナウイルス性疾患19(COVID 19)は公衆衛生上の問題となっており、その有病率は国によって異なるが、世界195カ国に存在している。COVID-19による死亡リスクは、ドイツでは1%、イタリアでは11%と差があり、60歳以上での死亡率が高いことが示されている(1)。

ヒトでは、膜貫通型セリンプロテアーゼ(TMPRSS2)は膜貫通型セリンプロテアーゼファミリーに属するプロテアーゼであり、TMPRSS2は上気道、気管支、肺で広く障害されていた。

TMPRSS2は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS-CoV)や中東呼吸器症候群関連コロナウイルス(MERS-CoV)などのコロナウイルス融合糖タンパク質、スパイクタンパク質を切断した(2)ACE2受容体に結合した後、宿主細胞への侵入を促進し、ウイルスの侵入を2.6倍に増加させた。

また、TMPRSS2を発現している細胞では、TMPRSS2を発現していない細胞と比較して、RNAとSARS-CoVのレベルが9倍に増加している(3)。

 

現在、アジア人の肺組織におけるACE2の発現は、白人白人やアフリカ系アメリカ人よりもはるかに高いことが知られている(4)。ACE2はカルボキシペプチダーゼであり、Ang Iをアンジオテンシンに変換し(1-9)、Ang IIをアンジオテンシンに変換する(1-7)。

最近の研究・解析では、SARS-コロナウイルス(SARS-CoV)や新型コロナウイルス(2019-nCoV)が、受容体のスパイクタンパク質を介してアンジオテンシン変換酵素2を標的としていることが示唆されている。

ファンデルワールス力を維持する結合ドメインと、グルタミン残基479によるSARS-CoVよりも強い2019-nCoVの受容体結合ドメイン(RBD)は、2019-nCoVが人から人へ伝達するためにヒトACE2受容体上のリジン31を認識することができることも示した(6)。

 

ウイルスが細胞に侵入した後、レチノイン酸誘導性遺伝子I(RIG-I)様受容体(RLRs)が直接認識してウイルスに結合し、E3リガーゼによってユビキチン化され、NF-κBのリン酸化と活性化につながり、抗ウイルス活性を持つIFN-βの産生につながるなどの宿主防御機構を開始する(8)。

SARS-CoVのNタンパク質は、RIG-Iユビキチン化とIFN-βの合成を阻害することが知られている(9, 10)。また、SARS-CoV 感染時には ACE2 タンパク質がダウンレギュレーションされ、ACE2 活性が RAS に負の影響を与え、肺を傷害から守る効果があると考えられている(11)。

その結果、IL-8サイトカインやIL-6サイトカインなどのプロ炎症性サイトカインが大量に分泌される。IL-8およびIL-6は、順番に、単球、マクロファージ、NK、好中球、さらに単球の感染部位への遊走を刺激する(12)。

Ang II は NF-κB 遺伝子の発現を亢進させることで抗炎症作用を持ち、ACE2 は Ang II のアポトーシスや IL-1β、TNF-α の分泌を抑制することで抗炎症作用を持つ(13)。

 

ウイルス誘発性炎症および組織傷害の主要な発症機序の一つはフリーラジカルの発生であった。また、ウイルスが宿主細胞に侵入した後には、ウイルスの複製を促進するために酸化ストレスが誘導された(14, 15) 一方、ACE2 レベルの増加は、2019-nCoV との結合において競合する可能性がある(16)。

李Fら(2005)の研究では、ACE2は可溶性の形で注入されたことを示している宿主細胞(7)にウイルスの入力を遅くすることができる。同様に、張Rらは、ACE2は、傷害(17)(図1)から肺を保護していることを示している。

図1

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図 1.

COVID-19は、NF-κB経路の活性化と活性酸素の生成を介して炎症と細胞損傷を誘導し、プロ炎症性サイトカインの産生と二次的な細菌感染を引き起こす(17)。

ウイルスの侵入を抑制

Nrf2 活性化因子は、セリンプロテアーゼ活性を阻害する分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤(SLPI)のような抗プロテアーゼ分泌を増加させ、プロモーターと結合して TMPRSS2 発現を減少させることで、ウイルス感染から標的細胞を保護することができる(21)。

飯塚らの 2005 年の研究では、Nrf2 ノックアウトマウスでは SLPI が発現しておらず、プロテアーゼ/抗プロテアーゼバランスが乱れて炎症を起こしやすい細胞になっていることを発見し、Nrf2 を活性化することで抗酸化作用だけでなく、プロテアーゼ/抗プロテアーゼバランスを維持することで SLPI 遺伝子の発現が増加することを明らかにしている(22)。

同様に、Ling JXら(2012)は、EGCG(Nrf2 活性化剤)の経口投与により、オセルタミビルの経口投与と同等の効果で、肺へのウイルス性肺炎の侵入と複製を減少させ、生存率を向上させることを示した。

歯槽保護の役割

ACE2 を発現している細胞は肺胞上皮 II 型細胞が最も多く、その約 83%を占めていると考えられている(23)。また、ACE2 タンパク質は肺頂気道上皮に豊富に発現しており、ACE2 の発現は上皮の分化に関連している可能性が高い。このように、よく分化した細胞はSARS-CoVに感染しやすい(24)。

Nrf2は、ACE2の発現量の増加とAT2Rの発現量の増加により、肺損傷の変化を抑制した。一方、Nrf2は、Ang II/AT1R軸に起因する酸化ストレス、炎症、線維化を抑制し、Ang IIの血清レベルとAT1Rの発現を低下させた(25)。

Kesic らの研究では、Nrf2 活性化剤が RIG-I や IFN-β の抗ウイルス遺伝子の発現を誘導することが示されている(26)。

抗炎症・抗アポトーシス活性

Nrf2 経路は、NF-κB が Nrf2 転写-CBP と反応すると、ユビキチン化による IKKβ の分解と遺伝子転写誘導を介して NF-κB の活性を阻害する。Nrf2 依存性抗酸化遺伝子の活性化は、セレクチンや接着分子VCAM-1のダウンレギュレーションに加えて、TNF-α、IL-6、MCP-1、MIP2などの炎症性因子の産生を抑制する(27) (28)。

Nrf2は、これらの受容体の発現を抑制することでTLRsの発現に重要な役割を果たしている(29)。Liらは、Nrf2ノックアウトマウスは野生型マウスに比べてTLR4の発現が増加することを観察している(30)。

Yanzhe Wangら(2018)は、免疫組織化学で測定した場合、Nrf2活性化剤処理はコントロールと比較してTLR陽性細胞の数を減少させることを観察した(31)。

Nrf2の活性化は、細胞内抗酸化物質であるグルタチオンとは独立したメカニズムを介して、肺胞マクロファージによるファゴサイトーシスおよびクリアランスを改善することができる(32)。Nrf2は、γ-グルタミルシステインリガーゼの制御と放出調節を介してGSHの主要な調節系である(33)。

Nrf2は、NQO1、HO-1、SODs、Grx1、Trx1などの多くの抗酸化酵素の産生を誘導し(34)、HO-1、Bcl-2/Bax、カスパーゼ3、9の発現と活性を低下させる(35)。

フマル酸ジメチル(DMF)

DMF(フマル酸エステル)は、多発性硬化症(MS)および乾癬の治療薬としてFDA(米国食品医薬品局)に承認されたばかりの薬剤で、市場名はTicfedra(ティックフェドラ)である(36)。

DMFは、Cys-179のIKKβに結合し活性化することでNF-κB経路を阻害し、NF-κBの放出を抑制する。この結合は、NF-κB の細胞質内での複合体(NF-κB-IκB)からの放出を阻害し、それによって下流のプロ炎症性シグナル伝達経路を阻害する(37)。

さらに、グルタチオン系の調節や酸化ストレスに対する細胞応答の亢進などの作用がある(38)。

DMFの作用機序は、Nrf2の活性化とNF-κBの活性を阻害することで、炎症の抑制に重要な役割を果たしている。DMF 非存在下では、Nrf2 は Keap1 に結合してユビキチン化される。

DMFはKeap1とNrf2の複合体のシステイン残基を破壊し、Nrf2の放出と核への移動を引き起こす(37)。DMFはCys-179でのIKKβの結合と活性化を介してNF-κB経路の強力な阻害剤である。

この結合は、細胞質内の複合体(NF-κB-IκB)からのNF-κBの放出を阻害し、それによって下流のプロ炎症性シグナル伝達経路を阻害する(38)(図4)。

図4.
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DMF(38)の作用機構(s)を示す概略フロー図

結論

結論として、そして支持する文献レビューから、DMFは抗プロテアーゼ(SPLI)の増加と同時にプロテアーゼ蛋白質(TRMPSS2)の減少を介して肺胞細胞へのnCOVID-19の侵入を抑制することができる可能性が示唆されていることは魅力的である。

さらに、DMFは抗酸化酵素の誘導によるNF-kBの抑制により炎症や活性酸素を減少させ、それによりTLRの調節を低下させ、遺伝子発現の誘導、ACE2酵素の増加、AT1Rの減少を介してRIG-1やINFなどの抗ウイルスメディエーターを増加させることができる。

このように、COVID-19患者においては、DMFの臨床試験が推奨されるべきである。

NRF2の活性化はCOVID-19に対する戦略となり得るか?

Can Activation of NRF2 Be a Strategy against COVID-19?

pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32711925/

ハイライト

宿主の炎症反応は疾患転帰を決定する重要な因子であり、現在までに治療法がない SARS-CoV-2 誘発感染症では、疾患の重症度と相関している。

転写因子核内因子エリスロイド2 p45関連因子2(NRF2)の活性化は炎症の収束を促進し、同時に細胞の酸化還元とタンパク質の恒常性を回復させ、組織の修復を促進する。

NRF2は、NRF2の主要な負の調節因子であるKelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1)を標的とする薬理学的誘導因子によって活性化され得る。

NRF2活性化剤であるスルフォラファンおよびバルドキソロンメチル(他の疾患の適応で先行臨床試験中)のヒトにおける薬物動態、薬力学、安全性および有効性に関する情報は、COVID-19を用いた無作為化臨床試験の優れた候補となっている。

SARS-CoV-2による急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、主に宿主の反応異常の結果として、肺胞細胞の損傷と肺線維化が起こる。増悪した炎症性サイトカインの放出(サイトカインストーム)とTリンパ球の損失(白血球減少症)は、最も侵攻性の高い症状を特徴づける。我々は、核内因子エリスロイド2 p45関連因子2(NRF2)の薬理学的活性化に基づく多面的な抗炎症戦略がウイルスに対して展開できることを提案する。この戦略は、レドックスおよびタンパク質の恒常性を回復し、炎症の解消を促進し、修復を促進することで、強固な細胞保護を提供する。スルフォラファンやバルドキソロンメチルなどのNRF2活性化剤はすでに臨床試験が行われている。これらの活性化剤のヒトにおける安全性と有効性に関する情報は、前臨床モデルでの細胞保護作用や抗炎症作用についても十分に報告されており、COVID-19に対する戦場での展開の可能性を強調している。

重症COVID-19病理における炎症の増悪

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス(MERS-CoV)、そして最近ではSARS-CoV-2などのコロナウイルスの発生時における数多くの臨床観察から、ウイルスの伝播に加えて、宿主の炎症反応が疾患の転帰を決定する重要な要素であることが確信を持って示されている[1]。致死率は病原体の細胞溶解作用ではなく、宿主の免疫系によって調整された炎症反応と関連している[2]。本疾患の最も重篤な症例では、サイトカインストーム(サイトカインの過剰産生)[3]がT細胞の枯渇、肺炎、および肺障害と関連している。急性呼吸窮迫症候群(ARDS;用語集を参照)や他のタイプのウイルス性肺炎を示す患者にも、マクロファージ活性化症候群(MAS)の特徴が見られる[3]。また、T細胞数が約2倍に減少する白血球減少症も認められており[4]、これは主に免疫系の細胞に影響を及ぼす細胞死の一形態であるピロプトーシスの結果であると考えられている[5]。一方、顆粒球症は、活性酸素種(ROS)の一種であるスーパーオキシド[2]の強力なバースト[6]や、炎症性サイトカイン[7]の追加産生の一因となっている可能性がある。

COVID-19(SARS-CoV-2に起因する疾患)の症状を総合的に管理するためには、抗ウイルス療法を補完する抗炎症療法を導入するための最も適切な文脈を理解することが極めて重要である。このような治療法は、ウイルスに対する宿主の効率的な適応免疫応答を変化させることなく炎症を抑制しなければならない。我々は、細胞保護転写因子NRF2(遺伝子名NFE2L2)を標的とした内因性細胞防御の増強は、COVID-19に関連した炎症の解消を促進し、また、レドックスホメオスタシスを回復させ、組織修復を促進することを提案する。議論の対象となっているタンパク質は、ミトコンドリアの生合成に関与する全く異なる転写因子である核呼吸因子2(GA結合タンパク質転写因子サブユニットβ、遺伝子名GABPB1としても知られている)とは明確に分離されていることに注意すべきである[8]。

NRF2とその抗炎症的役割の概要

NRF2はcap’n’colar(CNC)転写因子であり、小柄な筋骨隆々性線維肉腫(sMAF)タンパク質、K、G、またはFとヘテロ二量体化し[9]、または転写因子C-JUNおよびJUNDとヘテロ二量体化し[10]、抗酸化応答エレメント(ARES)に結合し、細胞の酸化還元恒常性、解毒、高分子損傷修復、および代謝バランスに関与するタンパク質をコードするものを含む標的遺伝子の転写を制御する[11]。基底条件下では、NRF2は、ユビキチン化とプロテアソーム分解のために転写因子を標的とするE3リガーゼ基質アダプターKelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1)と相互作用する[11. 電着剤および活性酸素(総称してインデューサーと呼ばれる)は、特定のセンサーシステイン残基を修飾することによってKEAP1を不活性化し[14]、その結果、NRF2の蓄積および標的遺伝子の転写が増強される。

図1

 

図1要図。SARS-CoV2のウイルス周期の仮説 NRF2活性化との潜在的なクロストークのポイントを強調している。

NRF2活性は、糖尿病、肝疾患、炎症性腸疾患を含む疾患状態では頻繁に調節障害を受けており[15]、加齢とともに低下する[16]。これらの疾患状態(例:糖尿病)および高齢化は、SARS-CoV-2誘発性ARDSと関連する危険因子である[17]。重要なことに、NRF2の活性化は、炎症性の合図に応答して肺の構造を維持することに関与していることが示されており、NRF2活性化の治療効果は、呼吸器感染症およびARDSを含むいくつかの肺疾患の動物モデルで報告されている[18]。さらに、NFE2L2(NRF2をコードする)のプロモーター領域に位置する一塩基多型(SNP)は、ヒトの肺疾患感受性に関与しており、NRF2は肺疾患の治療標的として強化されている[19,20]。

NRF2はまた、IL-6やIL1Bなどの炎症促進遺伝子を抑制することにより、炎症の実行と解決の両方で役割を果たしている[12] [21]。これは、リポ多糖類(LPS)刺激マクロファージ細胞において特に顕著であり、これらの細胞の代謝リプログラミング中に蓄積される抗炎症性免疫代謝物イタコン酸がNRF2を活性化する[22]。さらに、NRF2はまた、組織修復に関与するいくつかのマクロファージ特異的遺伝子の転写を誘導する。これらには、細菌の貪食に必要な受容体であるコラーゲン構造を持つマクロファージ受容体(MARCO)、酸化低密度リポタンパク質(LDL)のスカベンジャー受容体であるクラスター分化36(CD36)[24]、およびウイルス感染に対する保護を与えるIL-17D[25]が含まれる[26]。同様に、NRF2の活性化は、グルタチオン(GSH)、NADPH、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、およびペルオキシレドキシンを増加させることで酸化ストレスから保護し、マクロファージや他の免疫細胞の古典的な炎症性活性化よりも代替的な創傷治癒を促進することで、酸化還元の恒常性を回復させる [27]。

ウイルス感染におけるNRF2

ウイルス感染におけるNRF2の役割は、DNAウイルスとRNAウイルスの両方の文脈で研究されてきた。一般的に、ウイルスは宿主細胞においてNRF2を活性化または阻害することで利益を得ることができる [28]。これは、感染の段階[29]やウイルス伝播の特定のメカニズムなどの因子に依存している可能性があり、感染細胞の死とウイルスの溶出、またはウイルス伝播を助けるための炎症反応の減少を伴う感染細胞の生存のいずれかを有利にする[30]。風邪および肺疾患に関連するヒトコロナウイルスHCoV-229Eの場合[31]、NRF2標的遺伝子グルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PDH)の発現欠損は、活性酸素産生を増加させ、ウイルス遺伝子発現および粒子産生を増強する[32]。重大なことに、NRF2経路はCOVID-19患者の肺生検で抑制されることがわかっている;逆に、NRF2の薬理学的誘導剤はSARS-CoV2の複製および炎症反応を抑制する[33]。

興味深いことに、炎症を起こした組織では、NRF2とNF-κBの間に相互のクロストークがあり、そこでは自然免疫細胞がリクルートされている[34., 35., 36.]。SARS-CoV 感染後、マウスの肺やヒトの単球マクロファージでは、NF-κB が試験管内試験(in vitro)で活性化され、逆に NF-κB を阻害すると炎症が減少し、マウスの SARS-CoV 感染後の生存率が向上する[7,37]。このように、NRF2 の薬理学的活性化は、SARS-CoV-2 感染によって肺に生じる NF-κB 介在性の炎症過程を制限する可能性がある。

SARS-CoV-2 の生物学および NRF2 とのクロストークの可能性

SARS-CoV-2ゲノムは、複製に必要な非構造タンパク質(nsp)、スパイク(S)、エンベロープ(E)、膜(M)、ヌクレオカプシド(N)を含む構造タンパク質、および宿主細胞と相互作用する付属タンパク質ORF3、6、7a、7b、8、および9bをコードしている[38]。SARS-CoV-2のSタンパク質に含まれる受容体結合ドメイン(RBD)は、宿主細胞のアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)と相互作用し、ウイルスの侵入を可能にする(図1)[39]。心血管疾患の患者に広く処方されているACE阻害剤/アンジオテンシン受容体拮抗剤の使用は、ACE阻害剤の標的であるアンジオテンシンIIが血管収縮作用、抗炎症作用、抗酸化作用、および抗血栓作用を有するため[40]、現在、COVID-19(臨床試験番号si NCT04311177、ロサルタン使用のためのNCT04312009)で検討されている[41]。しかし、これらの阻害剤はACE/ACE2のバランスを変化させ、ACE2レベルを上昇させ、その結果、ウイルス侵入のためのドッキングサイトの数を増加させる可能性がある[42]。

NRF2欠損症はACE2をアップレギュレートすることが知られているが、その活性化剤であるoltiprazはACE2レベルを低下させる [43] ことから、NRF2の活性化により、SARS-CoV-2の細胞内への侵入に対するACE2の利用可能性が低下する可能性が示唆される(図1)。
他のコロナウイルスとの類似性から、SARS-CoV-2 は宿主の翻訳機械系を修飾して自身のタンパク質を生成することが期待されている(図 1)[44]。このステップに対する宿主の対策としては、SARS-CoV感染に応答して活性化されることが知られている3つの細胞性eIF2αキナーゼのうちの2つ、プロテインキナーゼR(PKR)およびPKR様小胞体キナーゼ(PERK)による真核生物開始因子2(eIF2)の不活性化が挙げられる[45]。興味深いことに、PKRはまた、オートファジーカーゴタンパク質p62をアップレギュレートする可能性を持っており、このタンパク質は、KEAP1との結合のためにNRF2と競合し[46]、KEAP1のオートファジー分解をさらに促進し[47]、その結果、NRF2の転写活性を活性化する(図1)。さらに、SARS-CoV感染では、Sタンパク質を含むコロナウイルスタンパク質の翻訳を宿主が阻害することで、アンフォールドタンパク質応答(UPR)が誘発され、NRF2をリン酸化して活性化するPERK[48]が活性化されることが観察されている[49]。このことは、宿主細胞のSARS-CoV-2感染の可能性を減少させるためにNRF2を調節することができる1つのステップであると考えられる。

RNAウイルスに感染した細胞は、RNAセンサーであるレチノイン酸誘導性遺伝子I(RIG-I)およびメラノーマ分化関連タンパク質5(MDA-5)[50]、およびDNAセンサーであるサイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)などの細胞質およびエンドソーム受容体によってウイルス分子パターン、特に核酸を認識し、適切な免疫応答を媒介するためにインターフェロン遺伝子のアダプタータンパク質刺激因子(STING)を介してシグナルを送る[51]。これらの生得的検出システムは、インターフェロン調節因子3(IRF3)介在性のI型およびIIII型インターフェロン(IFN)の転写を活性化する[51]。コロナウイルス感染(SARS-CoVを含む)は、STING媒介の宿主免疫系に拮抗することが示されている[52,53]。I型IFNは、自己分泌性および副分泌性のI型IFN受容体シグナル伝達を活性化することにより、ウイルスの複製および拡散を抑制するために極めて重要であるが、感染した肺胞細胞または常駐マクロファージによるIFNの過剰な放出は、追加の単球由来マクロファージの肺浸潤を悪化させ、炎症性障害をさらに増強させる可能性がある[54]。NRF2は、一部ではSTING発現をダウンレギュレートすることにより、IFN産生をダウンレギュレートする[55,56](図1)。したがって、NRF2はIFNの過剰な産生を防ぐことで、ウイルス感染に対する炎症反応を減衰させる可能性がある。

さらに、NRF2の転写標的であるヘムオキシゲナーゼ1(HO-1、遺伝子名HMOX1)のアップレギュレーションは、HIV、C型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、エンテロウイルス71(E71)、インフルエンザウイルス、呼吸器同期ウイルス(RSV)、デングウイルス(DENV)、エボラウイルス(EBOV)を含む多くのウイルスに対する抗ウイルス応答と関連している[57]。HO-1はIRF3とヘテロ二量体を形成することで抗ウイルス応答を媒介することができる[58]。この相互作用により、IRF3はリン酸化されて核に移動し、そこでI型IFNの発現を誘導する(図2)。

図2

図2

図2 NRF2の標的であるHO-1の抗ウイルス活性

HO-1 によるウイルス感染の制御については他にもいくつかのメカニズムが報告されており、これらのメカニズムはある程度 SARS-CoV-2 にも当てはまると考えられている。HO-1はヘムの分解を触媒して、ビリベルジン、Fe2+、COという3つの生成物を生成し、それぞれが抗SARS-CoV-2活性を持つと考えられている。コロナウイルスは、ウイルスのポリプロテインを処理し、ウイルスの複製に不可欠な、3C様プロテアーゼ(3CL-pro)およびパパイン様プロテアーゼ(PLpro)というウイルスプロテアーゼを産生する [59]。3CL-ProとPLproは共に、ビリベルジン[61]によって阻害されることが知られている他のウイルスプロテアーゼ[60]と高い相同性を持っている(図2)。ビリベルジンは、SARS-CoV-2の3CLproとPLproの両方を阻害すると予想される。遊離Fe2+は、HCVのRdRpの高度に保存された二価金属結合ポケットに結合し、その酵素活性を阻害する(図2)[62,63]。この結合ポケットはSARS-CoV-2において高度に保存されているため[64]、同様のメカニズムにより、COVID-19に対するNRF2/HO-1媒介の抗ウイルス活性が付与される可能性がある。さらに、COは、E71 [65]やウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV9)[66]のようなポジティブセンス一本鎖RNA(+ssRNA)ウイルスに対して抗ウイルス応答を誘発し、この効果はCOドナーによって表現されている。CO放出分子2(CORM-2)は、可溶性グアニルシクラーゼ(sGC)の活性化に依存するメカニズムを介して、cGMPの局所レベルを上昇させ、プロテインキナーゼG(PKG)を活性化する(図2)。これにより、PKGはNADPH酸化酵素(NOX)[67]を阻害し、そうでなければ炎症の一因となる活性酸素レベルの上昇を防ぐ(図2)。これらのメカニズムがCOVID-19のコンテキストでもミラーリングされている場合、NRF2/HO-1経路の活性化は、SARS-CoV-2感染を軽減するために有望である。

COVID-19の潜在的な抗炎症療法のための利用可能なNRF2活性化剤の兵法

SARS-Cov-2に対する有効な治療法を開発するための重要な制限は、動物モデルにおけるCOVID-19の再現性の低さであり、そのほとんどは関連する生理学を共有しておらず、適切な免疫応答を示さず、または関連する臨床症状を示さない[68]。それにもかかわらず、遺伝的または薬理学的なNRF2活性化は、動物およびヒトの他の病態において一貫して抗炎症および抗ウイルス効果を示してきた。NRF2調節の最も生理学的および薬理学的に関連するメカニズムは、KEAP1内の特定のシステインセンサーを標的とすることによるものである[11]。ウイルス感染に対するNRF2活性化剤の使用に関する包括的なレビューが最近発表された[69]。感染細胞における酸化還元恒常性の変化および肺の炎症が呼吸器ウイルスによる感染の特徴であることを考えると [70]、気道に影響を与えるウイルスから得られる情報は、COVID-19への外挿に関連しているかもしれない。実際、実験的証拠が出始めており、NRF2活性化剤であるフマル酸ジメチル(DMF)および内因性抗炎症代謝物イタコン酸の細胞透過性アナログである4-オクチルイタコン酸(4-OI)が、COVID-19患者の末梢血単核細胞(PBMC)を含むヒト細胞において、SARS-CoV2に対する炎症反応を抑制することが最近実証された[22]。

臨床開発中のKEAP1を標的としたNRF2活性化剤が最近報告されている[11,71]。ここでは、NRF2/KEAP1軸を標的とする唯一の薬剤として米国食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)に承認されているDMF [72] と、先行臨床試験が行われており(表1)、COVID-19患者に対する治療効果を検討するためにすぐに臨床試験に移行できる2種類のNRF2活性化剤について紹介する。

表1 KEAP1を標的とした4種類のNRF2活性化剤であるスルフォラファンおよびその内包変異体であるスルフォダレックス(SFX-01)、バルドキソロン-メチルおよびその構造アナログであるオマベロキソロン(RTA-408)の炎症・感染症に関連した臨床試験の抜粋
化合物疾患 臨床試験 臨床試験識別子

原文参照

フマル酸ジメチル

DMFは多発性硬化症(MS)や乾癬の治療に使用されており、肺疾患にも有益な効果があると考えられている[73]。DMFは、脱髄を防ぐ役割に加えて、NRF2の抗酸化・抗炎症反応を増強し、IL-17Aを抑制することで、MS様疾患を引き起こす+ssRNAウイルスであるTheiler’s murine encephalomyelelitis virus (TMEV)から保護している[74]。しかし、NRF2/KEAP1軸とは関係のない、よく特徴づけられたオフターゲット効果は、MS患者のサブセットで発生する白血球減少症である[75]。白血球減少はCOVID-19の重症例の特徴であることを考慮すると、この設定でのDMFの潜在的使用は注意して考慮されるべきである。

スルフォラファン

イソチオシアネートスルフォラファン(SFN)は、古典的なNRF2ターゲットであるNAD(P)H:キノンオキシドレダクターゼ1(NQO1)の誘導剤としてアブラナ科植物のブロッコリーから分離されたものである[76]が、最も強力な天然由来のNRF2活性化剤であり、抗酸化作用および抗炎症作用については十分な文書化がなされている[77]。

SFNとその安定化α-シクロデキストリンカプセル化版スルフォラデックス(SFX-01)の高いバイオアベイラビリティーは、過剰な抗炎症反応を緩和し、肺を保護するための優れた候補になる。SFNは、ウサギのARDSモデル[78]やマウスの高酸素誘発性肺損傷モデル[79]などの呼吸器疾患の動物モデルにおいて、肺を保護することがわかっている。また、NRF2欠損マウスではなく、野生型マウスの肺におけるRSVの複製とウイルス誘発性炎症を制限している[80]。HIV-1トランスジェニックラットでは、SFNはGSHレベルとNQO1の発現を増加させ、肺胞上皮細胞間のタイトジャンクションを回復させた[81]。

インフルエンザA感染の試験管内試験(in vitro)モデルでは、SFNはウイルス細胞の侵入と複製の両方を減少させた[82]。さらに、SFNはHCV複製を抑制し[83]、HSV-1ウイルス産生を減少させる[29]。興味深いことに、SFNは、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン(NOD)、ロイシンリッチリピート(LRR)、およびパイリンドメイン含有タンパク質(NLRP)1および3インフラマソーム(宿主免疫の恒常性を形成する重要な自然免疫構成要素)およびピロプトーシスを、部分的にはNRF2に依存しない方法で阻害する[84]。さらに、喫煙者(肺の感染症や損傷などのリスクが高い患者コホート)を対象とした興味深い研究では、SFNが鼻腔洗浄液の細胞におけるNQO1の発現を増加させ、生きた減衰型インフルエンザウイルスに感染すると、IL-6とウイルス負荷のレベルを低下させることが示されている[85]。

標準化されたブロッコリー抽出物、栄養補助食品、およびカプセル化された安定化スルフォラファン(プロスタファンおよびSFX-01)を含むスルフォラファンの供給源は、肺疾患からCOVID-19の病態生理に密接に関連する炎症性疾患に至るまでの適応症を対象とした数多くの臨床試験で実施されている。慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、アレルギー、鼻炎、加齢、糖尿病、ヘリコバクター・ピロリ感染症、くも膜下出血などの疾患を対象とした臨床試験が行われている(表1)。臨床試験は、COVID-19に外挿することができる広範な薬物動態、薬力学、安全性および有効性に関する情報を提供している[77]。特筆すべきは、これらの試験のほとんどは、ベースラインノイズを最小化し、スルフォラファンおよびその代謝物の血漿および尿中レベルを正確に検出するために、試験期間中はアブラナ科植物を含まない食事を推奨していることである[86]。

バルドキソロンメチル(CDDO-Me)およびオマベロキソロン(RTA-408

天然物のオレアノール酸に由来する半合成五環式トリテルペノイドは、現在までに知られている中で最も強力な NRF2 活性化剤であり、サブから低ナノモル濃度範囲での活性を持つ [87]。初期の研究では、18種類のトリテルペノイドの抗炎症作用とNRF2誘導作用が6桁の濃度で直線的に相関していたことが強調されており、2つのプロセスが機械論的にリンクしていることが示唆されている[88]。Ganoderma lucidumから分離されたいくつかのトリテルペノイドは、DENVのNS2B-NS3プロテアーゼの潜在的な阻害剤であることが明らかにされている[89]。SARS発生後の2003年に実施された研究 [90] では、甘草の根から分離されたトリテルペノイドであるグリチルリチンが、SARS患者から分離された2つのコロナウイルスの臨床分離株において、SARS-CoVの複製を阻害することが明らかになった。

グリチルリチンのNRF2に対する潜在的な効果は研究されていない;しかしながら、グリチルリチンは他の環境でNRF2を活性化することが示されており[77,91]、観察された抗ウイルス効果の少なくとも一部はNRF2の活性化によるものであると考えられる。

半合成五環式トリテルペノイドであるバルドキソロンメチル(CDDO-Me)は、DENVおよびジカウイルス(ZIKV)の両方に対して幅広い抗炎症活性を有することが示されている[92]。前臨床モデルでは、バルドキソロンメチルはNRF2依存性の炎症と酸化ストレスの抑制を通じてLPS誘発急性肺損傷を緩和した[93]。バルドキソロンメチルの抗ウイルス特性は、HBV、HCV、およびHSV1感染の細胞培養モデルにおいても示されており、細胞内のHBV RNAプレゲノムレベルを低下させ、HCVゲノム複製を抑制し[94]、HSV1ウイルスの産生を抑制した[29]。バルドキソロンメチルおよび近縁のアナログであるオマベロキソロン(RTA-408)は、肺高血圧症、肺動脈性肺高血圧症、および眼炎症など、炎症および酸化ストレスが疾患発症の背景にあるさまざまな適応症を対象に、現在臨床試験が行われている(表1)[95]。

NRF2が第一のメディエーターであるにもかかわらず、SFN、バルドキソロンメチル、およびオマベロキソロン(RTA-408)の抗炎症効果には、追加の因子が寄与していることに注意することが重要である。したがって、SFNは、NF-κB[96]、NF-κBキナーゼサブユニットβ(IKKβ)の阻害剤、およびSTAT3[98]を阻害し、一方、バルドキソロンメチルは、IKKKβ[99]、およびSTAT3およびSTAT5の活性化を阻害する[100]。全体として、これらの化合物のNRF2活性化作用と抗炎症作用の組み合わせは、非常に強固な細胞保護作用をもたらす。これらの化合物は、COVID-19の症状の管理のための研究の対象となる可能性がある。

COVID-19に対するNRF2活性化剤と他の抗炎症アプローチの比較

COVID-19患者で観察された悪化した炎症は、コルチコステロイドや非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)などの抗炎症薬で治療できる可能性がある。実際、英国のNational Health Service(NHS)病院のCOVID-19患者を対象とした無作為化多施設臨床試験であるRECOVERY(COVID-19治療の無作為化評価)試験では、副腎皮質ステロイドである低用量デキサメタゾンが、人工呼吸を受けている患者と酸素のみを受けている患者の死亡率を減少させたが、呼吸サポートを受けていない患者には効果がなかったことが明らかになった[101]。

NSAIDsによる結果はCOVID-19を有する患者では決定的ではないが[102]、NSAIDsであるイブプロフェンは、肺炎患者において好中球機能、炎症部位への好中球のリクルート、および炎症過程の解消を損なうことが示されている[103]。しかし、イブプロフェンは腎毒性[104]、心血管疾患、および脳卒中[105]の高率と関連しており、ARDSにおけるこれらの転帰のリスクを高めるようである[106]。

NSAIDsとNRF2活性化剤の間の有意な違いは、NRF2が実行と解決の両方に必要であるため、NRF2が炎症反応のはるかに統合的な調節を引き出すことである。さらに、内因性の細胞保護系を調節することにより、NRF2は、炎症の有益な効果と有害な効果との間のバランスを達成するために、より生理学的な役割を有する可能性がある。

COVID-19において大きな期待を抱く従来の抗炎症剤の別の代替手段は、COVID-19におけるサイトカインストームに関与するサイトカインを標的とする薬剤の使用である。これには、IL-6およびIL-1シグナル伝達を標的とすることが含まれる[107]。トシリズマブ(IL-6受容体に対するヒト化モノクローナル抗体)およびアナキンラ(組換えヒトIL-1受容体拮抗薬)がCOVID-19で再利用され、研究されている[108,109]。NRF2はIL-6およびIL-1β遺伝子の発現を阻害することが知られているため、NRF2活性化剤の使用は、これらのアプローチの優れた代替手段または並行手段である[21]。

まとめと今後の展望

ここ数ヶ月の間に、新型コロナウイルスSARS-CoV-2を原因とするCOVID-19は、世界的な規模で健康と社会経済に多大な影響を与えている。我々は、転写因子NRF2を薬理学的に標的とした抗炎症療法の可能性を提案している。SARS-Cov-2感染症において、NRF2を薬理学的に活性化することで、以下の3つの効果が期待できる。

(i) 宿主細胞の体力増強と保護、

(ii) マクロファージ活性化時の抗炎症表現型の促進による炎症性サイトカインの制御不能な産生と膿栓症の防止、

(iii) ウイルスの伝播の抑制である。

注目すべきことに、ビタミンCのような直接的な抗酸化物質は短命(数分から数時間)であり、活性酸素消去の過程で消費されるのとは異なり、NRF2活性化の抗酸化作用および細胞保護作用は長続きし、誘導剤の除去後も数日間持続する[110,111]。これは、低分子とは対照的に、半減期が長く [11] 、消費されず、代わりにそれらが触媒する反応中に再生される酵素によって媒介されるためである [112]。

DMF、スルフォラファン、およびバルドキソロンメチルを含むほとんどのNRF2誘導剤は、KEAP1のシステインセンサーを修飾し、そのリプレッサー機能を不活性化する電気泳動剤である。親電性のNRF2活性化剤を使用する場合の懸念点としては、以下のようなものがある。(i) 高用量での毒性の可能性 ・電気泳動剤はGSHと反応するため、高用量ではGSHの枯渇を引き起こす可能性がある;実際、電気泳動性代謝物は高用量のアセトアミノフェンの肝毒性の原因となっている[113]。(ii) 持続的なNRF2活性による酸化還元シグナル伝達の摂動の可能性。これらの懸念は、レドックスバランスの回復と炎症の解消を目的として、疾患が活動している時期にのみNRF2活性化の期間を含めるなど、臨床試験の設計において慎重に用量と投与レジメンを選択することで解決することができる。さらに、実験的証拠は、スルフォラファン(および他の電気泳動剤)の最大許容量が必ずしも最も効果的ではないことを示唆している[114]。このことから、KEAP1への結合を阻害する非親電性NRF2活性化剤の同定を目的とした研究が推進されており、有望な候補が出現している[71,115,116]。

NRF2経路におけるCOVID-19の候補薬を開発するための潜在的な関心領域は、NRF2活性化が加齢とともに低下すると増加するレベルを示す転写抑制因子BTBドメインおよびCNCホモログ1(BACH1)の阻害剤を同定することであろう(COVID-19の危険因子である)[18]。

議論された研究をまとめると、NRF2活性化がCOVID-19に対する戦略として有望であることが強く示唆される。しかし、この戦略を実施する前に、いくつかの重要な問題に対処することが望まれる(未解決の問題を参照)。例えば、SARS-CoV-2がNRF2を阻害するという知見[33]は、ウイルスが宿主細胞から本質的な細胞保護経路を奪っていることを示しており、ウイルス感染の過程でいつ、どのようにしてこのようなことが起こるのか、またその基礎となるメカニズムを明らかにすることが重要である。NRF2がマクロファージやT細胞の代謝リプログラミングや適応に寄与するかどうか、またCOVID-19の感染過程においてNRF2がそれらのエフェクター機能に影響を与えるかどうかは、現在のところ不明である。また、NRF2の薬理学的活性化が宿主細胞へのSARS-CoV-2の侵入を抑制できるかどうか、NRF2活性化剤がどのようにSARS-CoV-2の複製を減少させるか、この効果がNRF2、HO-1、あるいはNRF2によって制御されるタンパク質のより広範なネットワークに依存するかどうかを確立することも重要になるだろう。

しかしながら、スルフォラファンやバルドキソロンメチルのようなNRF2活性化剤は、他の適応症で既に先進的な臨床試験が行われているため、COVID-19患者を対象とした無作為化臨床試験での安全性と有効性に関する豊富な情報が得られていることから、これらの薬剤がCOVID-19患者を対象とした臨床試験への道筋は明確である。成功すれば、この治療戦略は、重度のCOVID-19患者の回復を改善し、機械的換気の必要性を減らすために迅速に動員され、世界中の集中治療室で現在経験されている膨大な負担を軽減することができる。

未解決の質問

SARS-CoV-2はどのようにして宿主細胞のNRF2をダウンレギュレートするのか、これはウイルス感染の段階に依存するのか?

NRF2はマクロファージおよびT細胞の代謝リプログラミングおよび適応に寄与し、COVID-19の経過中にそれらの抗炎症機能に影響を与えるか?

NRF2の薬理学的活性化は、宿主細胞へのSARS-CoV-2の侵入を減少させることができるか?

すべてのNRF2活性化剤は複製およびウイルス産生を減少させるのか、それともSARS-CoV-2の伝播の他の段階に影響を与えるのか?

影響があるとすれば、この影響はNRF2および/またはHO-1に依存するのか?

 

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