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新規コロナウイルス誘発NLRP3インフラマソーム活性化
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7248552/
COVID-19の治療における薬物標的の可能性
新規コロナウイルス（nCoV）は、プロテインE、オープンリーディングフレーム3a（ORF3a）、ORF8aなどのビロポリンと呼ばれるイオンチャネルタンパク質をコードしている。
これらのビロポリンは、リソソーム破壊や細胞内環境でのイオン再分配などのメカニズムを介して、自然免疫シグナル伝達受容体NLRP3（NOD-、LRR-、およびピリンドメイン含有3）のインフラマソームを活性化する。これにより、インターロイキン1β（IL-1β）、IL-6、腫瘍壊死因子（TNF）などの炎症性サイトカインが産生され、CoV感染による呼吸器疾患時に組織の炎症を引き起こす。
感染に対する炎症反応を誘発するこの重要な役割のために、NLRP3インフラマソームは、SARS-CoV-2によって引き起こされるコロナウイルス疾患2019（COVID-19）の治療における潜在的な薬物標的であるように思われる。
この原稿は、nCoVsの発症におけるNLRP3インフルアソームの重要性を強調し、その既知の阻害剤について議論し、SARS-CoV-2（COVID-19）の治療における潜在的な有益な効果のために、これらおよび類似の既知または新規の薬剤の評価に向けて注目を集めている。
21世紀に入り，3種類の新規コロナウイルス（nCoV）が出現した．最初のパンデミックは、2002年に中国南東部で発生した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）によるもので、次いで2012年に中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（MERS-CoV）が発生した（1）。
2019年後半に中国の武漢市で発生したSARS-CoV-2に起因する最近のパンデミックは、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）と名付けられた呼吸器疾患を引き起こしており、世界中で罹患率と死亡率を引き起こしている（2）。
CoVは、約30kbのポジティブセンス一本鎖RNAゲノムを持ち、ウイルスのヌクレオキャプシドは、スパイク（S）、膜（M）、エンベロープ（E）タンパク質がちりばめられたエンベロープに囲まれている（3、4）。スパイク（S）糖タンパク質は、宿主細胞表面のアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体と呼ばれる標的を認識して相互作用し、感染サイクル中のウイルスの侵入を仲介している（5）。
有望な治療標的を特定し、それを利用することは、ウイルス性疾患の治療において常に集中的に研究されている分野である。この点で、SARS-CoVのスパイク蛋白質もまた、ウイルス感染の重要なチェックポイント、すなわちウイルスの付着と宿主細胞への侵入に関与していることから、薬物標的と考えられている。
それにもかかわらず、他のウイルス-宿主相互作用メカニズム（以下を参照）も存在し、SARS-CoVによる感染症においては、潜在的な治療の標的となる可能性があると考えられている。
新規コロナウイルスの発症におけるNLRP3インフラマソームの役割
SARS-CoVは、他の動物ウイルスと同様に、ビロポリンと呼ばれる3つのイオンチャネル（IC）タンパク質、すなわちタンパク質E、オープンリーディングフレーム3a（ORF3a）およびORF8aをコードしている。これらのビロポリンは、ウイルス感染の過程でオリゴマー化して孔を形成し、宿主細胞の正常な生理的恒常性を乱し、ウイルスの病原性に寄与することが観察されている(4, 6, 7)。
SARS-CoVでは、ウイルスの最適な複製には、2つのビロポリン、すなわち、より支配的なタンパク質Eと、PDZ結合モチーフ（細胞タンパク質と相互作用するPBM）を持ち、IC活性を有するORF3aが必要であることが報告されている。
これらのうち、Eタンパク質はウイルスのウイルス性に必要であることが示された(8)。さらに、Eタンパク質が欠乏するとSARS-CoVの発症が抑制されるなど、Eタンパク質が必須であることが示された。
実際、Eタンパク質は、最終的に感染時の炎症をもたらすいくつかのシグナル伝達機構に関与している。
炎症性NF-kB経路の活性化やPBMとシンテニンタンパク質との相互作用によるp38 MAPKの活性化に加えて(9, 10)、小胞体ゴルジ体中間区画(ERGIC)/ゴルジ膜にカルシウムイオン(Ca2+)チャネルを形成している。
その結果、細胞内環境におけるカルシウムの恒常性の変化は、図1に示すように、細胞質性自然免疫シグナル伝達受容体NLRP3（NOD-、LRR-、およびピリンドメイン含有3）インフルナソームの活性化を導く（10）。
NLRP3は、カスパーゼ活性化・リクルートドメイン（ASC）を有するアダプター成分アポトーシス関連斑状タンパク質と、触媒的に不活性なプロカスパーゼ-1から構成されている（11、12）。
ウイルスRNAを含むいくつかの外部刺激や内部刺激が、イオン再分配を伴う細孔の形成やリソソームの破壊などのメカニズムを介してNLRP3インフラソームを活性化し、炎症とそれに伴うピロプトーシスと呼ばれる細胞死をもたらすことが示されている(13)。
NLRP3が活性化されると、そのプロカスパーゼ-1は活性なエフェクタープロテアーゼであるカスパーゼ-1に変換され、プロインターロイキン1β（pro-IL-1β）のようなプロ炎症性サイトカインの切断とその活性型IL-1βおよびIL-18への成熟を引き起こする。
これらは、インターロイキン6（IL-6）、腫瘍壊死因子（TNF）、プロスタグランジン、ロイコトリエンなどの炎症の下流の他のメディエーターのカスケードを誘発する（13、14）。
また、SARS-CoV感染したACE2-（ウイルス受容体）を発現する気管支・肺組織の上皮細胞、肺細胞、マクロファージにおいて、他のプロ炎症性メディエーターのうちIL-1βが産生されることが観察された（15）。
炎症性サイトカインを誘発するEタンパク質の役割と一致し、Eタンパク質のイオンチャネル活性が肺の炎症、体液の蓄積、気管支肺胞上皮の損傷を促進することも示された。
この役割をさらに確認するために、IC活性を欠いた変異型Eタンパク質を用いた研究では、特に組織の浮腫が減少したという点で良好な転帰が示されている(10, 16)。
さらに、これらの知見と一致するように、HIV-1 ウイルスの Vpu チャネル阻害剤であるヘキサメチレンアミロリド（HMA）は、培養細胞におけるコロナウイルスの複製を阻害し、ヒトコロナウイルス 229E（HCoV-229E）やマウス肝炎ウイルス（MHV）では、E タンパク質イオンチャネルのコンダクタンスを阻害することが観察された（17）。
同様に、カリウム（K+）イオンチャネルのビロポリンであるORF3aタンパク質は、宿主細胞のリソソームを機能不全にし、直接またはカリウム（K+）排出量の増加を介してカスパーゼ-1の活性化を引き起こし、NLRP3インフラマソームの活性化につながることが示された。
さらに、NF-κBを介したpro-IL-1βサイトカイン遺伝子の転写のアップレギュレーションと膿性細胞死を引き起こした（7、14、18）（図1を参照）。
図1
SARS-CoVのビロポリン媒介 NLRP3 インフラマソーム活性化、その阻害剤（アスタリスクで示されている）、および炎症と細胞死につながる下流の炎症性カスケードの模式図。
空欄には遺伝子（斜体）、灰色の欄にはそれぞれのタンパク質を示す。
したがって、それは、SARS-CoVがコードするビロポリン、すなわち、Eタンパク質およびORF3aがNLRP3炎症性カソームおよびアセンブリを活性化することが明らかである。
これは、SARS-CoV感染に対する宿主の炎症反応の一部として、IL-1β、IL-6、TNF、および他のメディエーターなどのサイトカインを含む炎症性カスケードの活性化につながり、組織の損傷に寄与する。
NLRP3 インフラマソーム COVID-19における薬物標的の可能性
NLRP3インフラマソームの最適な活性化などの自然免疫機構は、抗ウイルス宿主防御に重要な役割を果たしているが、その異常な活性化とその下流のメディエーターは、しばしば感染時に病理学的な組織傷害を引き起こす(19)。
また、SARS-CoVへの感染は、プロ炎症性サイトカイン、特にIL-1β、IL-6、およびTNFストームを誘発することが知られている。これらのサイトカインは、急性肺損傷（ALI）の一形態であり、しばしば死に至る急性呼吸窮迫症候群（ARDS）（10）を引き起こす組織炎症の進行に重要な役割を果たしている。
ARDSは、SARS-CoVおよびMERS-CoVに感染した患者の死亡原因の第一位であることは注目に値する(1)。いくつかの研究では、ARDSおよびALIの発症に関連して、NLRP3の炎症酵素活性化が重要な役割を果たしていることが報告されている（20-22）。
ARDSの発症は、これらのプロ炎症性サイトカイン、すなわちIL-1β、IL-6、およびTNFと炎症の他のメディエーターによって駆動される。これは、炎症性細胞や貪食細胞のリクルート、補体の活性化、オプソン化、内皮細胞や上皮細胞の透過性の亢進による気血関門の破壊、肺の肺胞へのタンパク質に富んだ液体の蓄積などの病理学的イベント、およびその他の全身的および血行力学的影響によって明らかになる(23-25)。
このサイトカインを介した免疫病理学と一致するように、ARDS患者の気管支肺胞ラベージや血漿中にもIL-1β、IL-6、TNFの上昇が観察されている(26)。さらに、これらのサイトカインの血清レベルとARDS患者の死亡率との間には正の相関があることが観察されている(27)。
SARS-CoVsによる感染症において、NLRP3の炎症性が強いことから、NLRP3は重要な薬剤標的であると考えられ、その阻害はCOVID-19との関連においても、組織の炎症を抑制する可能性がある。
いくつかのSARS-CoV-2がコードするインフラマソーム活性化因子（ビロポリン）とSARS-CoVのそれとの乖離が観察されていることに基づいて、これらのウイルスタンパク質の、特にNLRP3インフラマソーム活性化に関連したメカニズムの比較研究は、まだ実施されていない。
それにもかかわらず、サイトカインストームはCOVID-19の炎症の主な原因であり、NLRP3インフラマソームの重要な役割を強調している。したがって、COVID-19患者では、高レベルのIL-1βおよび他のサイトカインが検出されている(28)。
一方、レムデシビル（29）、ファビピラビル（30）、グルココルチコイド（31）、クロロキン（32）、ヒドロキシクロロキン+アジスロマイシン（2）などの様々な薬剤が最近、その潜在的な有益な効果について試験されているが、重篤なCOVID-19患者では、気道管理と人工呼吸器のサポート（33）が治療の主役であることに変わりはない。
炎症を引き起こすサイトカインの重要な役割を考えると、生物学的製剤を用いてサイトカインの作用を遮断することは、関節リウマチ、乾癬、炎症性腸疾患、およびその他の自己炎症性疾患の治療に革命をもたらした(34)。
同様に、SARS-CoV-2によるサイトカイン介在性炎症反応に基づいて、IL-1受容体拮抗薬アナキンラ、IL-6受容体に対する抗体トシリズマブ、抗インターフェロンγ（IFN-γ）抗体エマパルマブなどのサイトカインを標的とした生物学的製剤も臨床研究で検討されている。
しかしながら，新型SARS-CoV-2（COVID-19）に対しては，死亡率を低下させるための有効な治療法が切実に求められている。特に様々な炎症性疾患におけるNLRP3の役割との関連で、NLRP3のインヒビターの潜在的な阻害剤を見つけるための努力がなされてきた。
幸いなことに、天然物や承認された医薬品を含む、いくつかのNLRP3インフルアソーム阻害剤が確認されている（図1を参照）。抗炎症作用が知られている天然物としては、オリドニン（Rabdosia rubescens 植物に含まれる）やパルテノリド（feverfew 植物に含まれるセスキテルペン・ラクトン）、合成化合物であるBay 11-7082や関連するビニルスルホン化合物などがあり、NLRP3 イン フラマソームを阻害することで効果を発揮することが示されている。
興味深いことに、パルテノリドとBay 11-7082は、NLRP3 炎症ソームと炎症性NF-κB経路を阻害し、SARS-CoV感染動物において肺の炎症を減少させ、生存率を改善することが示されている(9, 35, 36)。また、糖尿病2型の治療に広く使用されているスルホニルウレア剤であるグリブリドも、NLRP3イン フラナソームを阻害することが示されている（9, 35, 36）。
主に膵臓のβ細胞のATP感受性K+チャネル（KATP）をブロックすることで作用し、グリブリドは上流に作用してNLRP3インフルナソームの活性化を抑制することが示された。
興味深いことに、グリブリドが介在するK+流出の阻害は、RNAウイルス、すなわち、小胞性口内炎ウイルス（VSV）や脳筋心筋炎ウイルス（EMCV）に感染した細胞において、NLRP3とIL-1βの分泌を阻害することが示された（19, 37）。
同様に、気管支喘息などのアレルギー性疾患の治療に用いられるトラニラストは、NF-κB経路やいくつかのサイトカイン、NLRP3のオリゴマー化を阻害し、インフラマソームの集合を抑制することが示されている。
これらの効果に基づき、トラニラストは、ヒトのNLRP3の炎症アソーム関連疾患の動物モデルにおいて有意な有益な効果を示した(38)。
さらに重要なのは、チューブリンの破壊、内皮表面のE-selectin分布の変化、接着分子L-selectinの消失誘導、好中球の接着・リクルートの防止などの作用で知られるアルカロイド剤コルヒチンも、NLRP3インフラマソームの活性化を阻害することが示されていることである。その後、プロ炎症性のIL-1βやIL-18サイトカイン産生をブロックすることにつながった(39, 40)。
コルヒチンは、痛風関節炎（41）や家族性地中海熱（FMF）などの自己炎症性疾患によく使用されている（42, 43）。しかし、NLRP3 炎症アソームの活性化を阻害することによる抗炎症作用は、急性冠症候群（ACS）（44）、酸化低密度リポ蛋白（oxLDL）やコレステロール結晶誘発性マクロファージ活性化（45）、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）誘発性小腸障害（46）などの他の疾患でも示されている。
NSAIDsは、プロスタグランジンおよび他のメディエーターの合成におけるシクロオキシゲナーゼ（COX）酵素を阻害する抗炎症薬のグループであり、疼痛および炎症の治療に広く使用されている。
フェナム酸塩（メフェナム酸、フルフェナム酸）は、他のNSAIDsとは異なり、シクロオキシゲナーゼ-1（COX-1）媒介の抗炎症活性とは無関係に、膜容積調節アニオン（Cl-）チャネル（VRAC）を阻害することを介して、NLRP3フラマソームおよびIL-1β放出を選択的に阻害することが研究により示されている（47）。
これらの知見と一致して、フェナム酸塩（メフェナム酸およびメクロフェナム酸）は、ウイルス複製に対してかなりの活性を有することが観察され、リバビリンとメフェナム酸の併用は、ポジティブセンスRNAゲノムのチクングニヤウイルスに感染した細胞におけるウイルス収量を減少させるのに有効であることが示された（48）。
MCC950（49）、CY-09（50）、OLT117（51）、およびベンゾオキサチオール誘導体BOT-4-one（52）のような他のいくつかの化合物は、NLRP3炎症性疾患を阻害することが示されており、NLRP3関連の炎症性疾患との関連で議論されてきた。
要約すると、本稿では、SARS-CoVsに起因する疾患の発症におけるNLRP3イ ンフラソーム活性化の重要な役割を概説し、炎症性疾患との関連でNLRP3イ ンフラソーム阻害剤が報告されていることを論じ、SARS-CoV-2（COVID-19）の治療におけるこれらの阻害剤（および類似の薬剤）の役割の可能性に注目している。
この目的のために、前臨床試験および／または臨床試験において、報告されているこれらの（および他の類似の既知または新規の薬剤）NLRP3インフルアソーム阻害剤を評価することは、特にCOVID-19の治療のために承認された薬剤の再利用の可能性という形で、新たな選択肢を提供する可能性がある。
さらに、他の炎症性疾患の治療のためにいくつかのNLRP3阻害剤が臨床的に使用されていることを考慮すると、これらの併存患者を対象とした対照試験は、COVID-19の治療におけるこれらの薬剤の潜在的な有用性を決定するかもしれない。
NLRP3インフラマソームの阻害
pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30185776/
IL-1βの成熟は、カスパーゼ1によるプロ-IL-1βのタンパク質分解的切断を通じて生成される。活性化には、インフラマソームと呼ばれる多タンパク質複合体の形成が必要。細胞で危険信号が感知されると、NLRP3がアクティブになり、ASCを動員してそのオリゴマー化を促進する。
ORF3a
SARS-コロナウイルスのオープンリーディングフレーム-3a(ORF3a)とEの両方が両方の信号をアクティブにすることができる。ORF3aオリゴマー形成の誘導を通じて受容体相互作用タンパク質3（Rip3）を介した壊死の誘導。
NLRP3インフラマソームの小分子阻害剤は、COVID-19の治療に役立つ可能性がある。
コロナウイルスはインフラマソームを活性化して、IL-1βなどの炎症性サイトカインの産生を増強する。
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7074995/
重度のCOVID-19：NLRP3インフラマソーム異常調節
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7332883/
治療オプション
臨床疾患を2つの段階に分けるには、二重の治療アプローチが必要となる(2)。最初の免疫防御に基づく防御期では、ウイルスの侵入を抑え、免疫系を強化することでウイルスを根絶する治療法が必要となる。第二の炎症に基づく損傷段階では、免疫系の内因性アジュバント反応を抑制する必要がある。
図2には、治療のための潜在的な選択肢が描かれている。これらの選択肢のそれぞれについて、多くの潜在的な候補が利用可能である。いくつかをハイライトし、これをまとめた他の著者を参考にすることにする。COVID-19を治療するためのNLRP3インフラマソーム阻害剤（Tranilast）の最初の臨床試験が進行中であり、中国の臨床試験登録簿に登録されている（45）。
他の研究はまだ前臨床段階にあり、急性肺損傷に対する効果や細胞株に対する効果、例えば
- レスベラトロール(46)、
- テトラサイクリン(47)、
- エリスロポエチン(48)、
- L型カルシウム拮抗薬のニカルジピン(49)、
- リドカイン(50)CP-456,773(51)、
- ディアセリン(52)
などを用いた研究が行われている。コルヒチンについては、NLRP3を介在する疾患に効果があるという仮説が立てられている(53)。いくつかのレビューでは、他のNLRP3インフラマソーム阻害剤が挙げられている(14, 16, 27, 54)。
治療のための第二の潜在的なターゲットはHMGB1である(55)。急性肺損傷または敗血症の実験モデルでは、HMGB1またはその受容体の1つをブロックすることで有益な効果が示されている(38, 40, 56, 57)。抗HMGB1はウイルスの増殖には効果がないにもかかわらず、ペラビミルとの併用により、好中球浸潤およびマクロファージの凝集に対する有意な効果が観察された(57)。
また、HMGB1を減少させる可能性のある治療法として、
- クロロキン（58）、
- メトトレキサート（59）、
- 抗酸化剤（60-62）、
- 漢方薬（63、64）、
- トロンボモジュリン（65）
等（66-68）が挙げられている。
重度の損傷を制限する別の選択肢は、好中球の数を減らすことであろう。すでにCOVID-19 CM4620-IEの第II相臨床試験が試験されている1 これは、肺内皮毛細血管バリアを安定化させ、好中球の浸潤を減少させ、肺障害を予防することを目的としたカルシウム放出活性化CRACチャネル阻害剤である(69)。
前臨床研究からいくつかの候補が挙げられるが、ガラクチン-9は好中球の浸潤を阻害し、MMPレベルを低下させ、さらにTh1およびTh17 T細胞をダウンレギュレーションする(70)と、一酸化炭素放出分子2から送達された外因性一酸化炭素は好中球の浸潤を阻害する(71)。
この治療はまた、試験管内試験（in vitro）でのNLRP3活性化(72)および生体内試験（in vivo）モデルでのHMGB1を阻害し(73)、これは現在のICUでも使用可能であることが示唆されている(74)。
最後に、NLRP3炎症アソーム活性化の下流メディエーターであるカスパーゼ-1、サイトカインIL-1β、IL-18およびそれらの受容体をブロックすることも、COVID-19関連肺炎の治療のための可能性のある選択肢である(75-77)。
メラトニン
アスコルビン酸
一酸化窒素