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クロロキンとメラトニンの宿主タンパク質標的としてのマトリックスメタロペプチダーゼ9のCOVID-19における免疫調節効果 ネットワークベースのメタ解析（抜粋）
Matrix metallopeptidase 9 as a host protein target of chloroquine and melatonin for immunoregulation in COVID-19: A network-based meta-analysis
ハイライト
・SARS-CoV患者のマイクロアレイデータを用いて、異なる発現遺伝子を同定した。
・COVID-19における再利用医薬品の同定
・PPI-CPI相互作用のネットワーク解析による新規ターゲットの探索
・MMP9を標的とした再利用薬としてのクロロキンとメラトニンの同定
・COVID-19におけるMMP9誘導免疫炎症の制御
要旨
目的
COVID-19の分子病態は他のコロナウイルス（CoV）感染症（重症急性呼吸器症候群（SARS））と類似している。適切な治療法がないため、本研究では、COVID-19の強力な再利用薬剤が標的とする宿主タンパク質を探索することを目的とした。
材料と方法
SARS-CoV患者血液のマイクロアレイデータレポジトリから、異なる発現遺伝子（DEG）を同定した。COVID-19の再利用薬剤は、利用可能な文献から選択した。DEGと薬剤を用いて、タンパク質-タンパク質相互作用（PPI）と化学タンパク質相互作用（CPI）ネットワークを構築し、それらを組み合わせてPPI-CPIネットワークのインタラクトームモデルを構築した。その結果、上位にランクされたサブネットワークとそのハブ・ボトルネックノードを機能的にアノテーションして評価した。
主要な知見
合計120のDEGと65の薬剤が同定された。PPI-CPIネットワーク（118ノード、293エッジ）は、トップランクのサブネットワーク（35ノード、174接続性）を示し、12のハブボトルネックノードは、6つのアップレギュレーション遺伝子と4つのダウンレギュレーション遺伝子に対応する10のタンパク質と関連してクロロキンとメラトニンの2つの薬物を持っていた。
2つの薬剤はハブ-ボトルネックノードと直接相互作用した。MMP9は好中球を介した免疫炎症と関連した機能的なアノテーションを示した。また、文献調査の結果、SARS-CoV-2ウイルスの膜受容体であるアンジオテンシン変換酵素2はMMP9と機能的に協力関係にあり、両薬剤との相互作用の可能性があることが明らかになった。
意義
本研究では、クロロキンとメラトニンの間で、メラトニンがCOVID-19の免疫不全を改善するために、MMP9に対する再利用薬としてより有望であることが明らかになった。
キーワード
COVID-19SARS-CoV-2CoronavirusPPI-CPIネットワークMMP9Chloroquineメラトニン
1. 序論
パンデミック「コロナウイルス病2019」（COVID-19）は、SARS（重症急性呼吸器症候群）-CoV-2または一本鎖RNAゲノムを含む新規コロナウイルスとしても知られるヒトコロナウイルス（HCoV）によって引き起こされる重篤な呼吸器疾患である[[1], [2], [3]。このウイルスは、主に発熱や筋肉痛などのインフルエンザ様症状と、乾いた咳や息切れなどの肺炎様症状を引き起こするが、極端な場合には急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、多臓器不全、死に至る可能性がある[2,[4], [5], [6], [7]。SARS-CoV-2 のヒトからヒトへの感染は、主に身体的接触、鼻腔内飛沫、調理されていない食品、およびコンシリエータ動物の排泄物によって起こる [1,2]。
SARS-CoV-2は、系統的にはβ-コロナウイルス属に属する他のHCoV、すなわちパンデミック性SARS-CoVおよびMERS（中東呼吸器症候群）-CoVに属する。SARS-CoV-2の全ゲノムはSARS-CoVと79%の塩基配列相同性を有している．表面エンベロープスパイク糖タンパク質-Sは、SARS-CoVとSARS-CoV-2の主要な抗原であり、アミノ酸配列の75%の類似性を有している。この糖タンパク質-Sは、ヒトのアンジオテンシン変換酵素サブタイプ2（ACE2）と呼ばれる受容体と結合し、複合体のエンドサイトーシスとウイルスの宿主細胞への侵入を可能にする[1,2,8]。HCoV感染時の宿主防御機構は、インターフェロンに対する免疫防御反応が遅くなることで、ウイルスの複製と生存に十分な時間が確保されるため、危険にさらされる[9]。臨床的には、COVID-19患者へのインターフェロン補充は、ウイルス負荷と炎症性侮辱を減少させることが報告されている[10]。
非ランダム化臨床試験[6,[11], [12], [13], [14], [15]および試験管内試験（in vitro）/培養試験[16], [17], [18]を用いた広範なレビュー分析により、抗ウイルス剤（レムデセビル）[13,14,16,17]、抗レトロウイルス剤（リトナビル）[13,14,16,17]、抗レトロウイルス剤（リトナビル）[16,17]を含むいくつかの承認された薬剤があることが明らかにされている。ダルナビル、ロピナビル）［13,15］、抗マラリア薬（クロロキン、ヒドロキシクロロキン）［13,14,16,17,19］、抗寄生虫薬（ニタゾキサニド、イベルメクチン）［14,18］、免疫抑制薬（トシリズマブ）［13］などがCOVID-19の治療法として選択されることがある。また、COVID-19に対する防御策として、SARS-CoV-2のスパイク蛋白質に対するモノクローナル抗体の開発が進められている[20]。さらに，ヒトコロナウイルスゲノムと宿主タンパク質の相互作用に基づくネットワーク解析により，抗炎症薬（メラトニン），非ステロイド性選択的エストロゲン受容体モジュレーター（トレミフェン），アンジオテンシン受容体拮抗薬（イルベサルタンなど），免疫抑制薬などの再利用薬が，COVID-19の標的となる可能性が示唆されている． イルベサルタンなど）、免疫抑制剤（シロリムスなど）、抗悪性腫瘍剤（メルカプトプリンなど）、および抗ウイルス活性を有する天然植物産物（エモジン）がCOVID-19の治療の候補となる可能性がある[21]。しかしながら、これらの薬理学的薬剤はすべて、その用途に一定の制限がある。
COVID-19の分子病態とその最適な治療法に関する情報が乏しいため、本研究では、統合的な蛋白質-蛋白質ネットワーク解析と化学蛋白質ネットワーク解析を用いて、(a)ヒトで最も効果的な宿主蛋白質標的と(b)標的に対する薬物の候補を明らかにし、COVID-19の治療戦略をよりよく理解するために、薬物と標的となる宿主蛋白質との間の機能的な関連を確立することを目的としたシステムバイオロジー的なアプローチを用いている。
3. 結果
本研究で得られた結果は、COVID-19の標的生体分子に対する潜在的な薬剤の知見とともにフロー図に体系的に記載されている（図1）。
3.1. SARS-CoV患者血液のマイクロアレイデータを用いたDEGの同定
SARSマイクロアレイデータセットのin silico解析により、120の異なる発現遺伝子を同定し、そのうち45の遺伝子がアップレギュレーションされ、75の遺伝子がダウンレギュレーションされた。これらの遺伝子の詳細を、遺伝子識別子（ID）、偽発見率（FDR）調整p値（<0.05）、log2（倍数変化）値（>1）を含めて図2に示す。
3.2. COVID-19のPPI-CPIネットワークの相互作用モデルの構築
SARS-CoV患者のDEGに対応するタンパク質を用いて、STRING webtoolでPPIネットワークの相互作用モデルを構築した。PPIネットワークには72個のタンパク質ノードと212個の接続が存在した（データは示されていない）。文献調査の結果、COVID-19の治療薬として提案されている65種類の薬剤（表1）が見つかり、これらの薬剤は、潜在的なタンパク質標的に対して最も強力な薬剤を選択するための解析に含まれていた。COVID-19治療薬候補とSARS-CoV患者のDEGを用いて、STITCH webtoolを用いてCPIネットワークの相互作用モデルを構築した。その結果、CPIネットワークには88のノード（タンパク質と薬剤）と120のコネクションが存在することがわかった（データは示されていない）。
表1. COVID-19に関する最近の文献から選択された潜在的な薬剤候補の要約。薬物は作用機序に基づいて分類されている。
分類 薬物候補
- 鎮痛剤ジペロドン、フェナゾピリジン、テトラジン
- 抗菌性のジヒドロcelastryl ジアセテート、Monensin ナトリウム、オリゴマイシン、サリノマイシン ナトリウム、ヴァリノマイシン
- 抗うつ薬 デシプラミン
- 抗真菌剤アンチマイシンA、エクサラミド、フェニルメルキュリックアセテート
- 抗ヘルミン剤ピルビニウムパメート、イベルメクチン
- 抗ヒスタミン剤 クロロピラミン
- 降圧剤アルプレノロール、ベルバミン、カルベジロール、ドキサゾシンメシル酸塩、イルベサルタン、プロプラノロール
- 抗感染性の塩化セチルピリジニウム、カンファー
- 抗炎症コルヒチン、エモジン、メサラジン
- 抗マラリア薬 クロロキン、コネシン、ヒドロキシクロロキン、キナクリン
- 抗悪性腫瘍剤 ダクチノマイシン、ヒドロキシカルコン、リコリン、メルカプトプリン、マイコフェノレートモフェチル、マイコフェノール酸、プリステメリン、トレミフェン
アンチパーキンソンのハルミン - 抗寄生虫剤ニタゾキサニド
- 抗精神病薬プロマジン
- 抗ウイルス剤 アシクロビル、ファビピラビル、ガンシクロビル、ロピナビル、オセルタミビル、ペンシクロビル、レムデシビル、リバビリン、リトナビル、チロロン
Ca2+チャネル遮断薬 ロペラミド - 利尿剤エプレレノン
- エストロゲン ステロイド エクリン
- ホルモン・メラトニン
- IL-6阻害剤 トシリズマブ
- 免疫抑制剤 シロリムス
- 筋弛緩剤パパベリン、ゾキサゾラミン
- PAF阻害剤 チクロピジン
- タンパク質合成ブロッカー シクロヘキシミド、エメチン
- 選択的セロトニン再取り込み阻害剤パロキセチン
- ステロイドホルモン オキシメトロン
- セリンプロテアーゼ阻害剤ナファモスタット
4. 議論
本研究では、SARS-CoV感染における異なる発現遺伝子（図2）とCOVID-19（表1）の再利用薬に基づいて、化学タンパク質相互作用ネットワーク（図3A）を構築した。好中球の活性化および脱顆粒経路に関与していると思われるサブネットワーク（図3B）が同定された（図5）。
また、細胞マトリックスの分解に関与する免疫原性プロテアーゼであるハブノードMMP9が、COVID-19におけるクロロキン（抗マラリア薬）とメラトニン（松果体ホルモン）という2つの有望な薬剤候補（図3Bおよび4C）の標的（図5）であることが明らかになった。ここで、データ統合を用いた系統的な分析アプローチは、COVID-19におけるグローバルなシステムレベルの関係（薬物対標的対機能的アノテーション）を明らかにする。
ARDSはCOVID-19および他のコロナウイルス感染症の罹患の主な原因である[[5], [6], [7],37,38]。サイトカインストームは、多臓器不全と死に至るARDSの重要なメカニズムである[5,6,39,40]。現在まで、COVID-19の分子病態は明らかにされていない。そのため、SARS-CoV/MERS-CoV感染のメカニズムが類似していることは、COVID-19の発症機序の分子レベルでの理解に大きく貢献すると考えられる[6]。
本研究では、好中球の活性化と脱顆粒の両方の統計的に有意な経路を含むサブネットワーク（図3B）を同定した（図5）。このサブネットワークは、ノード（タンパク質）が29.66%、ネットワーク全体の59.38%の接続性を提供しており、ネットワークモデル全体の中でこのサブネットワークが非常に重要であることを示している（図3A-B）。
グローバルおよびローカルトポロジカル解析により、それぞれのアップレギュレーション遺伝子に対応する6つのタンパク質（CAMP、ELANE、FOXO3、ITGAM、MMP9、MPO）と、それぞれのダウンレギュレーション遺伝子に対応する4つのタンパク質（CCT2、SIRT1、SMAD4、STAT1）からなる10の潜在的なタンパク質分子が提供された。
これら10のノードは、PPI-CPI相互作用ネットワークのハブノードと考えられ、さらなる研究のために選ばれた（図4C）。これらの分子はすべて、COVID-19の抗菌薬誘発性好中球介在性体液性および自然免疫応答後の血中に高濃度に濃縮されていることが明らかになった（図5）。
本研究では、PPI-CPIインタラクトームネットワークの中心ハブノード（タンパク質）および薬剤の標的としてMMP9が機能的に重要なハブノード（タンパク質）であることが明らかになった（図3Bおよび4C）。亜鉛含有およびカルシウム依存性のタンパク質分解エンドペプチダーゼであるマトリックスメタロペプチダーゼ（MMP）は、細胞内の貯蔵物から放出され、細胞外で活性化する[41]。
MMPは、炎症を含む様々な生理学的および病理学的プロセスにおいて、細胞外マトリックスのリモデリングを助ける多くの細胞外マトリックスタンパク質の劣化を引き起こす［[41], [42], [43], [44]］。
MMPは組織内に広く分布しており、その発現はサイトカイン、成長因子、ホルモンによって制御されている。タイプIVコラゲナーゼ活性を有する糖タンパク質であるMMP9（83kD）は、好中球、リンパ球および樹状細胞に存在し、血管新生および炎症性サイトカイン生成に関与している[41,44]。本研究では、Enrichr 機能解析により、MMP9 が遷移イオン結合（遺伝子オントロジー上の分子機能）、好中球活性化と関連免疫（遺伝子オントロジー上の生物学的プロセス）、癌や B 型肝炎感染症における転写ミスレギュレーション（KEGG パスウェイ）、ヒトにおける関節炎、脳浮腫、感冒感染症（ジェンセン病）などの多様な病態と関連していることが明らかになった（図 5）。
また、機能パスウェイエンリッチメント解析を用いた計算科学的研究では、多様なウイルス感染症におけるMMP9遺伝子発現の双方向性制御が報告されており、MMP9が再利用薬のターゲットとして予測されている[45]。
MMP9は、生理的条件下では低レベルで構成的に発現している。MMP9の作用は、セリンプロテアーゼ（プラスミン）によるプロペプチドの活性化と、マトリックスメタロプロテアーゼ1（TIMP1）との複合体形成による阻害のバランスに依存している。したがって、MMP9系の制御異常（遺伝子発現、翻訳後修飾、活性化因子対抑制因子のレベル）は、病理学的状態の発現につながる[46,47]。好中球における低レベルのTIMP1と持続的なMMP9活性は、急性炎症反応と関連して気道のリモデリングとうっ血を引き起こし、ARDSと急性喘息の両方の発症に関与している[[48], [49], [50], [51]]。
最近、COVID-19患者の気管支肺胞液中のTIMP1の遺伝子発現は、1人の患者ではアップレギュレーションを受け、別の1人ではダウンレギュレーションを受け、他の3人の患者の血液単核細胞ではアップレギュレーションを受けていることが明らかになっている[52]。今回の通信では、Enrichr機能解析（遺伝子オントロジーの下にある細胞成分データベース）により、MMP9と3次顆粒を放出するルーメンの機能的側面との関連が示された（図5）。MMP9は好中球活性化時のサイトカイン放出のための第三次ルーメンとの関連が報告されている[53]。
単球およびマクロファージでは、MMP9はプラスミンによって過剰に活性化され、「toll like receptor 9」（TLR9）シグナルと反応して腫瘍壊死因子（TNF）の形成を誘導し、炎症性サイトカインストームの発生を誘導する [54,55]。MMP9とセリンプロテアーゼ活性の関与は、遺伝子オントロジー下の分子機能を用いたEnrichr機能解析においても明らかにされている（図5）。
MMP9 欠損はマウスモデルにおいて重症 H1N1 インフルエンザウイルス A 感染に対する保護効果が認められている[56]。したがって、我々の知見および他の報告は、MMP9の阻害および／またはその活性化剤（プラスミン）および阻害剤（TIMP1）の改変へのアプローチが、致命的なサイトカインストームおよびCOVID-19患者の生命リスクを防ぐ可能性があるという見解を支持している。
ここで、クロロキンとメラトニンの両方が、MMP9の相互作用パートナーであると思われる再販薬候補として同定された（図3Bおよび4）。クロロキン治療は、全身性エリテマトーデスでは血清MMP9レベルを低下させ[57]、乳がんではMMP9活性とそのmRNA発現を抑制する[58]。また、クロロキンはTNF介在性好中球アポトーシス、好中球脱顆粒およびサイトカインバーストを低下させる［[59], [60], [61], [62], [63]］。
クロロキン/ヒドロキシクロロキンは試験管内試験（in vitro）でヒトレトロウイルスの活性を効率的に阻害する[64]。最近、多くの研究[17,65,66]および臨床試験[67]は、COVID-19の治療へのクロロキン/ヒドロキシクロロキンの使用を支持している。
逆に、特定の臨床研究では、COVID-19患者において心不全を発症することから、その使用に強く反対するものもある[68], [69], [70]]が、クロロキン/ヒドロキシクロロキンに関する臨床データが決定的なものではないことを示している[71]。注目すべきことに、ヒドロキシクロロキンは、本研究のサブネットワークには現れず（図3B）、さらなる検討のために未達成のままであった。
メラトニンは、正常な睡眠とヒトの「体内時計」の維持に関与している[72]。メラトニンは抗炎症作用を有しており、抗ウイルス機序において潜在的な役割を発揮している[74], [75], [76], [77], [78] 、エボラウイルス感染症にも利用されている[78]。
COVID-19患者における病態生理学的観察は、その治療におけるメラトニンの慢性生物学的使用を支持しており[79,80]、この点に関する治療アルゴリズムも最近提案されている[81]。さらに、メラトニンはCOVID-19治療の有望なアジュバントとして報告されており[21,82]、メラトニンの欠乏はSARS-CoV-2感染症における糖尿病患者や高血圧高齢者の感受性を高める可能性がある[80]。
小規模コホートにおけるメラトニンの最初の臨床試験では、COVID-19患者におけるARDSの緩和にメラトニンが関与していることが示されている[83]。興味深いことに、メラトニンはMMP9の活性部位に結合し、MMP9を阻害して免疫炎症を停止させることができる[84]。したがって、今回のネットワークベースのメタアナリシスは、免疫不全のCOVID-19患者におけるメラトニンとMMP9の相互作用の関与を正当化するものであった。
細胞培養研究（腎臓細胞株Vero E6）とネットワーク解析から、クロロキン[85]とメラトニン[21]はそれぞれ、ヒト細胞膜結合型ACE2受容体、亜鉛依存性カルボキシペプチダーゼ、およびCOVID-19の他の関連タンパク質パートナーを標的とした抗ウイルス的な役割を果たしている可能性があることが明らかになった。
興味深いことに、別の研究では、ACE2ノックアウトマウスモデルでMMP9レベルが増加することが報告されており[86]、ACE阻害剤（リシノプリルおよびイミダプリル）もまた、ACE2とともにMMP9を標的としている[87]。
したがって、両メタロペプチダーゼ、すなわちACE2とMMP9はCOVID-19の免疫炎症に協力している可能性があり、クロロキンとメラトニンの両方の治療の潜在的なターゲットとなり得る。
SARS-CoV-2を含むコロナウイルスの表面スパイクの糖タンパク質-Sは、体内への侵入のために気道および肺の膜結合型ACE2受容体を認識する。ACE2は、膜貫通型セリンプロテアーゼ（TMPRSS2）とともに糖タンパク質-Sの構造変化を誘発し、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合を可能にするS-フラグメントを放出し、その後、エンドソームの形成を介してウイルスの内部化が行われる。
ウイルスRNAは宿主細胞内で処理され、ウイルスのレプリカが細胞外に放出される。ウイルス感染細胞は主要組織適合性複合体を介して抗原性ペプチドを提示し、サイトカインストームとともに体液性および細胞性免疫を誘発する[6,[88], [89], [90], [91], [92], [93]。膜結合したACE2のエクトドメインは、その可溶性形態として細胞外液中に排出される[88,[94], [95], [96]。
また、試験管内試験（in vitro）での研究では、可溶性ACE2はSARS-CoV/SARS-CoV-2に結合し、膜結合型ACE2受容体と相互作用するウイルスの利用可能性を制限し、それによってウイルスの負荷の可能性を最小限にすることが示されている[88,92,94]。
注目すべきことに、ACE2はアンジオテンシンIIをアンジオテンシン(1-7)に変換し、炎症過程の改変を引き起こすペプチドである[97]。アンジオテンシン(1-7)には血管拡張作用もあり[98]、脳の尾側髄質に作用する心拍数を増加させる[99]ことから、SARS/COVID-19患者に見られるような低血圧や頻脈の発症に寄与すると考えられている[100]。
さらに、SARS/SARS-CoV-2と嗅粘膜の支持細胞のACE2受容体との相互作用は、炎症誘発性の無呼吸にもつながる[101]。COVID-19の治療管理におけるACE2受容体とMMP9の制御的役割を解明するためには、さらなる実験的研究が必要である。
5. 結論
本研究では、ネットワークベースのシステムバイオロジーを用いて、(a)サイトカインストームの増強因子としてのMMP9遺伝子のアップレギュレーションとMMP9タンパク質の活性・活性調節因子の状態がCOVID-19の病因生理の鍵を握っている可能性があること、(b)クロロキンとメラトニンがMMP9を標的とした薬剤であり、COVID-19患者のARDS症状に伴う免疫炎症カスケードを軽減する可能性があることを明らかにした。
また、クロロキンとメラトニンの治療効果は、SARS-CoV-2の細胞膜ACE2受容体の活性に収束している可能性も示唆された。クロロキンは臨床試験で使用されている用量では細胞毒性を示すため、最近では魅力的な使用法とは言えない。この点で、メラトニンはより安全性の高い薬剤として期待されているが、COVID-19患者に対する有効性を確認するためには、大規模なコホートでの臨床試験が必要である。