論文：BioNTechのRNAベースのCOVID-19ワクチンには、SV40プロモーター/エンハンサー配列を含む大量の残留DNAが含まれている

BioNTech RNA-Based COVID-19 Injections Contain Large Amounts Of Residual DNA Including An SV40 Promoter/Enhancer Sequence

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ウルリケ・ケマーラー
ヴェレーナ・シュルツ
クラウス・シュテガー *

査読済み、臨床研究

2024年12月3日

要約

背景：BNT162b2 RNAベースのCOVID-19ワクチンは、免疫反応のためのスパイクタンパク質を効率的に生産するために、ヒト細胞にトランスフェクションすることが指定されている。

方法：我々は、HEK293細胞培養、免疫組織化学、ELISA、PCR、および質量分析を適用して、4つのドイツのBNT162b2ロットを分析した。

結果：HEK293細胞へのヌクレオシド修飾mRNA（modRNA）生物学的製剤の導入が成功したことを実証し、細胞培養数日間にわたって強固なレベルのスプイクタンパク質が生成されたことを示す。細胞上清への分泌は、主にエキソソームマーカーが豊富な細胞外小胞を介して行われた。さらに、これらのバイアルのRNAとDNAの含有量を分析したところ、臨床用量あたり32.7 ngから43.4 ngの範囲の濃度で、すべてのロットにおいてRNase A消化後に大量のDNAが確認された。これは、国際的な規制当局が設定した臨床用量あたり10 ngという最大許容濃度をはるかに上回る。選択したPCRプライマーペアを用いた遺伝子解析により、残留DNAはスパイク遺伝子をコードするDNAマトリックスの断片だけでなく、SV40プロモーター/エンハンサーおよび抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミド由来のすべての遺伝子を表していることが証明された。

結論：我々の結果は、BNT162b2ワクチンの安全性について重大な懸念を提起しており、これらの懸念が払拭されない限り、すべてのRNA生物学的製剤の即時中止を求めるものである。

キーワード

BNT162b2、細胞導入、Comirnaty、COVID-19、プラスミド、RNAワクチン、SV40プロモーター/エンハンサー

研究論文：BioNTechのRNAベースのCOVID-19ワクチンには、SV40プロモーター/エンハンサー配列を含む大量の残留DNAが含まれている　2024年12月3日https://t.co/g4bmhyFzgn
1. 残留DNA問題:
– 4つのワクチンロットを分析した結果、1回分に32.7-43.4ngのDNAが含まれていた。これは規制上限の4-5倍を超過…

— Alzhacker ᨒ zomia (@Alzhacker) December 3, 2024

はじめに

2020年、政治的に推進された「オペレーション・ワープスピード」[1,2]や「プロジェクト・ライトスピード」[3,4]のようなキャンペーンにより、最終的に世界人口70億人を対象としたCOVID-19ワクチン開発を目指す、全く新しいクラスの薬剤の開発が推進された[5]。これらのいわゆる「mRNAワクチン」は、以下ではRNA注射またはRNA生物製剤とも呼ばれるが、トランスフェクション能を有する脂質ナノ粒子（LNP）にパッケージ化されたヌクレオシド修飾mRNA（modRNA）で構成されている。その基本的な考え方によると、modRNAがいったん細胞内に入ると、その細胞にSARS-CoV-2スパイクタンパク質の生成を強制し、細胞表面に提示させる。その結果、提示されたスパイク抗原に対する特異的な抗体を生成する免疫系が刺激されることになる[6,7]。「科学のスピード」[8]と世界各国政府の要請により、メーカーは極めて短期間で大量のmodRNAを製造するという課題に直面した。そのため、第3相臨床試験で使用が承認されたmodRNA製造のためのDNAマトリックス生成の初期のPCRベースのプロセス（プロセス1）は、すぐに限界に達し、各社はバクテリア細胞培養システムで容易に増殖できるクローン化シャトルベクターによるDNAマトリックスの大規模生産（プロセス2）に切り替えた[9]。政府によるワクチン接種から始まり、このプロセス2の製品がオリジナル製品に代わって採用された。

2021年には、すでに、modRNAによって誘導されたスパイクタンパク質が、ワクチン接種者の血液中に注射から数週間後に循環していることが報告されている[10]。2022年には、最初の詳しい死後調査により、BNT162b2の最後の注射から数週間後に、血管壁やさまざまな組織の複数の部位にワクチンによって誘導されたスパイクタンパク質が存在することが明らかになった[11]。最近、妊娠中にRNA生物製剤を投与された女性の胎盤から、ワクチン由来のスパイクタンパク質が検出された[12]。Dhuli氏らは、BioNTech/Pfizerワクチンを2回接種した既往のあるlong-COVID患者の血液細胞に、modRNAの断片に対応する配列が存在することを報告している[13]。重要なのは、体内の細胞によるスパイクタンパク質の生成は注射部位に限られるわけではなく、メーカーや当局が主張していたように数日で終了するものではないということだ。これまでに、ワクチン接種を受けた人々におけるスパイクタンパク質の顕著な持続発現に寄与する可能性があるいくつかのメカニズムが示唆されている。

第一に、生物学的製剤には、その寿命を延ばすためにヌクレオシド修飾mRNA（modRNA）が含まれている[14]。また、Toll様受容体の検出をオフにして破壊を減らすこと[15]、および翻訳を最大限に高めることを目的としている。これは、天然のウリジンを合成のN1-メチル-シュードウリジン（mPsi）に置き換えること、およびグアニンとシトシンの含有量を増やすこと（コドン最適化として知られている）によって実現されている[6,14,16]。

第二に、ヒト細胞株HEK293T [17] およびHuh7 [18] におけるトランスフェクション実験のデータが示唆するように、トランスフェクトされたmodRNAは、LINE1（Long Interspersed Nuclear Element-1）媒介メカニズムを介して逆転写され、細胞ゲノムに組み込まれる可能性がある。

第三に、modRNAを細胞に送達する脂質ナノ粒子（LNP）には、modRNAのインビトロ転写のテンプレートとしてスパイクコードDNAが使用された製造プロセスに由来するDNAが含まれている可能性がある。残存するDNAはmodRNAから完全に分離されず、デオキシリボ核酸分解酵素（DNase-I）消化により分解され、その後、modRNAとともにLNPにパッケージ化される可能性がある。DNase-I が反応容器の表面に付着し、DNAとRNAのハイブリッドが存在すると効率が低下することはよく知られている [19]。 メーカーによると、「RNA調製品からDNAの一本鎖をすべて除去することは、おそらく不可能」である [20]。欧州医薬品庁とドイツのポール・エーリック研究所が、臨床投与量あたり10 ngの残留DNAを許容範囲と定めたという事実（実際、この範囲内のDNAが登録書類にも示されている[9]）を踏まえると、このDNAが脂質ナノ粒子にパッケージングされている可能性が高い。

この可能性は、2023年2月にマッカーナン氏とその同僚が、バイオンテック/ファイザー社およびモデルナ社のワクチンロットから、スパイクタンパク質をコードするDNAと発現ベクターシステム由来の残留プラスミドDNAの両方が大量に発見されたと発表したことで浮上した[21,22]。その大部分は断片化され直鎖状にしたDNAであったが、無傷のプラスミドも大腸菌細胞に正常にトランスフェクションできることが示された[21,22]。これらの完全なプラスミドが modRNA とともに脂質ナノ粒子にパッケージングされたと仮定すると、安定発現ベクターが細胞内に入り込み、コードされたスパイク領域の転写が可能な細胞であれば、長期間にわたってスパイクが豊富に生産されることになる。不可解なことに、BioNTech/Pfizer社のプラスミドには、モデルナ社のものには含まれていない細菌のT7プロモーターシステムだけでなく、哺乳類のシミアンウイルス40（SV40）プロモーター/エンハンサー配列も含まれている[23-25]。このことは懸念材料である。なぜなら、1999年にディーン（Dean）氏らは、プラスミドDNAの核への侵入、特に非分裂細胞においては、SV40プロモーター/エンハンサーの72bpの配列が必要であることを証明しているからだ[23]。注目すべきは、プラスミドDNAの核局在にはプロモーターも複製起点も必要ないということである[23]。一方、McKernanチームの結果は確認され、さらに拡張された[26]。最近、KönigとKirchnerは、複数のBNT162b2ロット内に大量の残留DNAが存在するというデータを発表した[27]。

こうした背景を踏まえ、私たちは以下の緊急の疑問に答える一連の実験を行った。まず、BioNTechのロット[27]に大量の残留DNAが存在すること、またPfizerのロット[21,22]に確認されたプラスミドでさえも、ドイツで配布されたBioNTechのみのロット（BNT162b2、Comirnaty）で、異なるDNA検出方法で確認できるだろうか？第二に、もし残留プラスミドまたはDNA断片が存在する場合、それらはコード化modRNAとともに効率的にヒト細胞に導入されるのか？第三に、これらの生物学的製剤は、スパイクタンパク質の持続的な細胞発現を誘導し、免疫攻撃の長期焦点を生み出す可能性があるのか？これらの疑問に答えるため、私たちはHEK293細胞を用いたin vitro細胞培養モデルを適用した。なぜなら、この細胞は分裂中のヒト細胞を模倣し、タンパク質生産の適切な標的であるだけでなく、導入された外来核酸と細胞ゲノムの潜在的な相互作用にも最も影響を受けやすいからである。すべての問題について肯定的な結果が得られたという事実から、BNT162b2ワクチンの安全性について最も強い懸念が生じる。

材料および方法

ワクチンロット

以下の未開封のBNT162b2ワクチンロットを使用した： FD7958（単価ワクチン、武漢由来、有効期限2021年10月）、FE6975（単価ワクチン、武漢由来、有効期限2021年10月）、EX8679（単価ワクチン、武漢由来、有効期限2021年8月）、HD9869（2価ワクチン、武漢/オミクロンXBB1.5由来、有効期限2024年10月）。PCR反応および質量分析の陽性対照として、SV40含有プラスミドの混入がすでに証明されているロットGH9715（二価ウイルス、武漢/オミクロンBA.4およびBA.5、有効期限2023年6月）を使用した[25]。バイアルは、製造業者の冷蔵状態で薬局から提供された。輸送および保管中は未開封で常に冷蔵されていた。

細胞株実験およびELISA

HEK293細胞は、加湿インキュベーター内で37℃、5% CO2の条件下で培養した。使用した細胞は、マイコプラズマ陰性であることが定期的に検査され、液体窒素中で小分けにして保存されていたオリジナルストック（Cell Lines Service GmbH、エッペンハイム、ドイツ）由来のものだった。細胞はトランスフェクション実験の前に新鮮な状態で融解し、10% ウシ胎児血清を添加した DMEM 培地で 10 cm ウェルディッシュでコンフルエントになるまで培養し、トリプシン処理（0.05% トリプシン/EDTA（Gibco #11500636；37℃で 3 分間））後に新しいウェルに移した。

すべてのトランスフェクション実験において、一価のmRNAを入れたバイアルは、メーカーの指示に従って、臨床濃度になるよう滅菌RNaseフリーリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1:5にあらかじめ希釈した。二価のバイアルは、臨床濃度がすでに存在していたため、事前希釈は行わなかった。ELISAでは、細胞密度が80%で、培地量が1mlの12ウェルプレートに、バイアル1本分の臨床用量の1/12（25μl）をトランスフェクションし、1日目、3日目、5日目、7日目に細胞と培地を採取した。7日目の非トランスフェクション細胞はネガティブコントロールとして使用した。タンパク質分析のため、それぞれの培養時間（上記参照）の後、細胞を滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、溶解バッファー（25mMトリス、150mM NaCl、1% Triton-X-100、 1% NP40、pH 7.6）で溶解し、市販の高感度S-Plex SARS-CoV-2 Spike ELISAアッセイ（Mesoscale Discovery K150ADJS）を使用して、タンパク質上清および培地中のスパイクタンパク質レベルを測定した。

免疫組織化学

免疫組織化学は標準プロトコルに従って実施した。 24ウェルプレート上の60%密着細胞に、200ml培地中の1ウェルあたり12.5mlの臨床用量をトランスフェクションした。 4時間のインキュベーション後、細胞を滅菌PBSで2回洗浄し、500mlの新鮮な増殖培地をウェルに添加した。トランスフェクション開始から24時間後、細胞を採取し、4%緩衝化パラホルムアルデヒドで固定し、2%アガロース/水に包埋し、生検サンプル用の標準的な脱水プロトコルを使用して脱水した。その後、アガロースブロックをパラフィンに包埋し、切断した。切片をスーパーフロストスライド上に置き、キシレンで2回脱脂し、エタノールと蒸留水の段階的なシリーズで水和した。水和および抗原回復（ACD biotechne #322000、15分間スチーマー）の後、スライドを透過処理（0.3% Triton-X-100/PBST）し、過酸化物抑制剤で処理 （サーモサイエンティフィック #35000）で処理し、1%ヤギ血清、1% BSA、0.1% Triton-X-100、0.05% Tween-20を含むPBSでブロッキングした。その後、スライドをSARS-CoV-2スパイクタンパク質（S1サブユニット）に対するウサギポリクローナル抗体（ProSci #9083）とともに4℃で一晩インキュベートし、PBSで洗浄した後、抗ウサギポリ-HRP抗体（Invitrogen #32260）とともに室温で30分間インキュベートした。タンパク質の検出には、恒久的なHRPグリーンキット（Zytomed）を使用し、ヘマトキシリンで対比染色し、RotiHistol IIキットに包埋した。

DNAおよびRNAの定量

各バイアルの臨床用量を1:10に希釈し、1% Triton-X-100を添加した滅菌RNase-free PBSで希釈した。RNAの定量には、希釈した臨床用量の10 µlを黒色96ウェルプレートに3回ずつ分注し、Qubit RNA High Sensitivity Assay（Invitrogen #Q32852）で処理した。dsDNAの定量には、希釈した臨床用量の10 µlを黒色96ウェルプレートに3重に分注し、Qubit dsDNA High Sensitivity Assay（Invitrogen #Q33 230）、Quanti-iT Pico Green dsDNA Assay（Invitrogen #P7589）、またはAccuBlue High Sensitivity dsDNA Assay（Biotium #31006-T）で処理した。RNase A（終濃度50 µg/ml、DNase-free Monarch RNase A #T3018L）処理は37℃で30分間行った。すべてのアッセイのシグナルは、励起波長483nm、蛍光波長530nmで標準プレートリーダーで定量した。キットで使用されたそれぞれの蛍光色素では、励起波長と蛍光波長間のシグナルの重なりはなかった。DNAとRNAの量を測定し（図1A-C）、1mgのRNAに対するDNA/RNA比を算出した。これらの比は、1mgのRNAあたり0.33mgのdsDNAというEMA規制と比較した。これにより、表3と図1Dの増加係数を取得した。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）

細胞からプラスミドDNAを単離するために、細胞密度が80%の6cmディッシュに、各バイアルの臨床用量の半分（150ml/ウェル）を1mlの培地に添加してトランスフェクションを行った。トランスフェクションを行わなかった細胞はネガティブコントロールとして使用した。6時間後に細胞を採取し、PBSで2回洗浄した後、プラスミドDNAを精製した（Gene Jet Plasmid Mini Kit）。1～10 ngのDNAを各PCR反応に分注した。

バイアル内のDNA含有量を測定するため、各バイアルの臨床用量を1:10に希釈し、1%のTriton-X-100を添加したEBバッファー（10mM Tris-HCl、pH 8.5）に添加した。PCR反応では、PrimerBlastを使用してプライマーを設計し、Eurofins Genomicsを通じて注文し、ヌクレアーゼフリー水に溶解し、最終濃度0.2mMとして使用した。発現ベクターに対するプライマー対の位置については、図3Aを参照のこと。 1 µlの希釈溶液をテンプレートとして使用し、標準Taqポリメラーゼプロトコル（94 °C 30秒、60 °C 30秒、72 °C、30秒、38サイクル）に従って処理した。Taq DNAポリメラーゼと標準Taqバッファー（New England Biolabs #M0273S）を使用した。陰性対照にはヌクレアーゼフリー水を使用した。バッチGH9715を含むバイアルを陽性対照として使用した。このバッチのプラスミドDNAはすでに単離および配列決定されており[21,22]、プラスミド配列BNT162b2（GenBank PP54 4445.1、GenBank PP544446.1、GenBank MQ287666.1は、BioNTechが発表した特許WO2021214204の配列16を表す）である。ロットGH9715から単離され、以前に配列決定されたプラスミドは、陽性対照として使用した。使用したプライマーは表1に記載されている。最後に、PCR反応物をエチジウムブロマイドを含む2%アガロースゲルに載せ、標準TAEバッファーで電気泳動を行った（実行時間：約1時間、100V）。DNAマーカーとしてGene Ruler DNA-Ladder Mix（Thermo Scientific #SM0331）を使用した。

表1.PCRに使用したプライマーの特性

EV分離および分泌タンパク質の濃縮

細胞を6cmのディッシュで80%の密度まで培養し、臨床用量の半分（150µl）の二価ロットGH9750を1mlの培地に添加してトランスフェクションした。トランスフェクションしていない細胞はネガティブコントロールとして使用した。6時間後、細胞を洗浄し、培地を5mlの新鮮な培地に交換した。さらに18時間後、培地を回収し、細胞をPBSで2回洗浄し、回収し、質量分析のためにさらに処理した。

EVの分離は、以前に報告されたように、EV表面のHSPへの結合を介してEVを沈殿させるVn-96ペプチド捕捉法を用いて行った[28,29]。簡単に説明すると、HEK293（トランスフェクション）細胞から得た細胞培養上清（2ml）にVN-96ペプチド（Microvesicle Enrichment kit、New England Peptide、#W1073-2、米国）20µlを加え、室温で1時間、回転ホイール上でインキュベートした。4℃で16,000 xgで15分間遠心分離し、EVを単離した。上清（可溶性分泌タンパク質）を新しいチューブに回収し、3kDa MWCOフィルター（Merck, アムステルダム、オランダ、カタログ番号UFC500396）を用いて濃縮した。EVペレットを、PIC（完全Mini EDTAフリー、#11836153001、Roche、ドイツ）を含む1mlのPBS（4℃）で1回洗浄した。

プロテオミクス用サンプル調製

プロテオミクス用サンプル調製は、以前に説明した方法に従って実施した [30,31]。 具体的には、タンパク質量にして約25mgに相当する細胞ペレット懸濁液の小分けを、30mlのLDSサンプルバッファー（10%ジチオスレイトール含有、Life Technologies, Carlsbad, CA, cat. no. NP0008）で溶解し、20mlの可溶性分泌タンパク質を10mlの3x LDSサンプルバッファーで溶解し、EVペレットを30µlの1x LDSサンプルバッファーで溶解した。その後、サンプルを99℃で5分間加熱し、超音波処理（3×20秒）を行った。NuPAGE SDS-PAGEシステム（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を使用し、プレキャストのBis-Tris 4-12%グラジエントゲルでゲル電気泳動を行い、室温で分画した。電気泳動後、ゲルを50%エタノール/3%リン酸（Merck、スイス）溶液で固定し、室温で一晩、コーマスリーブリリアントブルーR-250（Thermo Scientific、英国）で染色した。その後、ゲルを25mlの50mM炭酸水素アンモニウム（Fluka、Seelze、ドイツ）および25mlの50mM炭酸水素アンモニウムに50%アセトニトリルを加えた溶液（Biosolve BV、Valkenswaard、オランダ）で洗浄した。タンパク質は、25mlのジチオスレイトール中で56℃で1時間、また25mlの55mMのヨードアセトアミド（Sigma-Aldrich、米国）中で室温で45分間、それぞれゲル全体をインキュベートすることで還元およびアルキル化された。ゲルレーンを3つのバンドに切り分け、各バンドを約1 mm3の立方体に切った。各バンドのゲルキューブをSpeedVac遠心エバポレーターで50℃で10分間乾燥させ、6.25 ng/mlのシーケンスグレード修飾トリプシン（Promega、マディソン、米国）を約100～200 ml（十分に覆う量）加え、室温で一晩インキュベートした。各ゲルバンドから得られたペプチドを100-150mlの1%ギ酸で抽出し、100-150mlの5%ギ酸/50%アセトニトリルで2回洗浄し、凍結乾燥して-20℃で保存した。

質量分析法に基づくプロテオミクス

溶解物、EV、可溶性分泌タンパク質のラベルフリープロテオミクスは、TimsTOF-HT MS/MSシステム（ブルカー、ドイツ）に接続されたEvosepクロマトグラフィーシステムを使用して実施した。 ペプチド（Nanodropで測定した600 ng/サンプル）を0.1% FAに溶解し、製造元のプロトコルに従ってEvotips（Evosep、デンマーク）にロードした。ペプチドは、室温で移動相として0.1% FAおよび0.1% FA / 99.9% ACNを使用し、Evosep One液体クロマトグラフィーシステム（デンマーク、Evosep）で標準化された勾配を使用したナノフロー逆相液体クロマトグラフィーにより分離された。1日あたり30サンプル（SPD）の分析法は、15cm x 150μmの逆相カラムに1.5μmのC18ビーズ（Bruker Daltonics）を充填し、20μmの内径のフューズドシリカエミッター（Bruker Daltonics）に接続して使用した。ペプチドは、噴霧電圧を1500 Vに設定したナノエレクトロスプレーイオン源（Captive spray source、Bruker Daltonics）を使用して、TimsTOF HT（Bruker Daltonics）に導入した。TimsTOF HTは、ランプ時間を100 msに設定したDDA-PASEFモードで実行し、 topN 取得サイクルごとに 10 回の PASEF スキャンが取得され、サイクルタイムは 1.16 秒となった。 100 m/z から 1700 m/z の質量範囲、1.5 から 0.7 Vs cm-2 のイオンモビリティ範囲、および 0（未同定）から 5+ の電荷状態を持つプレカーサーが分析された。強度閾値は2,500の任意単位（a.u.）に、ターゲット値は20,000 a.u.に設定した。このターゲット値に達した、またはスケジュール容量が一杯になった前駆体は、0.4分間除外した。単一荷電の前駆体は、m/z-イオンモビリティの位置に基づいてフィルタリングされた。質量が700 Da未満の前駆体は四重極の分離幅2 Thで分離され、700 Daを超える前駆体は3 Thの幅で分離された。衝突エネルギーは、1.6 Vs cm-2で59 eVから0.6 Vs cm-2で20 eVまで直線的に減少した。すべての実験において、Agilent ESI LC/MS チューニングミックスの3つの選択イオンを使用して、イオンモビリティの寸法を直線的に校正した。[m/z、1/K0: (322.0481、0.7318 Vs cm−2）、（622.0289、0.9848 Vs cm−2）、（922.0097、1.1895 Vs cm−2）の3つのイオンを使用して、イオンモビリティの寸法を直線的に較正した。

MS/MSスペクトルは、レビュー済みのヒトプロテオーム（Uniprot、2023年3月、アイソフォームを含む42420エントリー）と、モデルナの mRNA1273発現ベクター、ファイザーの2価発現ベクターBNT162b2、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2の分離株であるウイルススパイクタンパク質の配列、さらにそれらのリボソームフレームシフト翻訳産物に対して検索を行った。酵素特異性はトリプシンに設定し、最大2つのミススプライシングを許容した。システインのカルバモイルメチル化（Cys、+57.021464 Da）は固定修飾として、メチオニン酸化（Met、+15.994915 Da）とN末端アセチル化（N-末端、+42.010565 Da）は可変修飾として処理した。ペプチドおよびタンパク質の同定は、デコイデータベース戦略を使用して、FDR 1%でフィルタリングした。 最小ペプチド長は7アミノ酸であった。 MS/MSスペクトルだけでは区別できないタンパク質は、タンパク質グループにグループ化された（MaxQuantのデフォルト設定）。 検索は、ラベルフリー定量オプションを選択して実行した。 タンパク質はスペクトルカウントにより定量した[32]。

結果

細胞へのトランスフェクションが成功すると、スパイクタンパク質の産生が起こる

modRNAを含有するリポソームナノ粒子は、哺乳類細胞へのトランスフェクションに強力なツールである [33]。 トランスフェクションの有効性を検証するために、4種類の異なるBioNTech（Comirnaty）ワクチンロット、すなわち単価ロットのFD7958、FE6975、EX8679、および2価ロットのHD9869を用いてヒト腎臓細胞（HEK293）をトランスフェクションした後、スパイクタンパクの発現パターンを分析した。4つのロットすべてにおいて、HEK293細胞への遺伝子導入は成功し、強いスパイクタンパク質の免疫組織化学的シグナルにより実証された（図1A）。スパイク陽性細胞による評価では、FD7958、FE6975、EX8679、HD9869、未処理細胞の遺伝子導入効率は、それぞれ90.5%、74.6%、76.4%、80.7%、0%であった。さらに、トランスフェクト細胞は、非トランスフェクト（コントロール）細胞株と比較して、大型の空胞および遊離細胞の形成により明らかな細胞障害性の兆候を示した（図1B）。スパイクタンパク質の時間経過に伴う発現安定性を定量化するために、市販のELISAを用いて、1日後、3日後、5日後、7日後の細胞溶解液中のスパイクタンパク質の量を測定した。4つのロットすべてが同じ発現パターンを示し、1日後にはすでにスパイクタンパク質が明確に発現し、5日後まで生産量が増加し、7日後には1日後よりもスパイク濃度がさらに高くなった（図1C）。

図1.BNT162b2生物製剤をトランスフェクションした後のHEK293細胞におけるスパイクタンパク質の発現。A: 免疫組織化学法により緑色に可視化された、異なるロットでトランスフェクションした細胞におけるスパイクタンパク質の染色。非トランスフェクション細胞（コントロール）では染色は認められない。ヘマトキシリンは核の対比染色として使用されている。B: 異なるロットでトランスフェクションしたHEK293細胞の明視野顕微鏡像では、細胞内小胞の形成が蓄積していることが示されている。C: ELISA法で測定した細胞内スパイクタンパク質（SP）濃度の経時的変化の定量。 n=2; mean+SEM. D: ELISA法で測定した分泌スパイクタンパク質（SP）濃度の経時的変化の定量。 HD9869ロットでは、分泌スパイクタンパク質濃度は検出限界以下であった。 n=2; mean+SEM. ネガティブコントロールでは、細胞溶解液および細胞上清にスパイクタンパク質は含まれていなかった。 SEM、平均標準誤差。

スパイクタンパク質はトランスフェクト細胞の培養液中に放出される

スパイクタンパク質が細胞表面に存在するだけなのか、あるいは細胞から遊離または分泌されるのかを判断するために、ELISA法を用いてトランスフェクト細胞の培養上清中のスパイクタンパク質を分析した。測定値は、0日目からそれぞれの時点までの累積量である。3つの単価ロットにおいて、培養液中のスパイクタンパク質の量が時間とともに明らかに増加していることが観察された。二価ロットのHD9869でトランスフェクションした細胞の培地中のスパイクタンパク質濃度はELISAの検出限界以下であった（図1D）。

スパイクタンパク質は主に細胞外小胞を介して放出される

膜タンパク質の細胞内部分は、細胞内のさまざまなセクレターゼによって膜表面で切断され、培地中に放出されるが、切断されていないタンパク質も細胞外小胞（エキソソーム）を介して細胞外に分泌される可能性がある。ロットGH9715をモデルシステムとして細胞株に人工トランスフェクションを行った後、どのメカニズムによってスパイクタンパク質が上清中に分泌されたのかを明らかにするために、質量分析法を用いた。この目的のため、トランスフェクション後24時間後にトランスフェクション細胞と培地を回収した。培地から細胞外小胞（EV）を分離した結果、プロテオームプロファイリング用の細胞溶解物、EV、EVを含まない培地の3つの画分を得た。3つの画分におけるスパイクタンパク質の存在量の結果は表2に示されている。スパイクタンパク質はライセートに最も多く（スペクトルカウント60）、またEVにもはっきりと存在していた（スペクトルカウント14）が、EVを含まない培地では低レベル（スペクトルカウント2）しか検出されなかった。重要なのは、コントロールのトランスフェクション細胞ではスパイクタンパク質は陰性であり、予想通り、一般的なEVマーカー（CD81、TSG101、alix）は可溶性分泌系よりもEV画分に豊富に存在し、トランスフェクション細胞と非トランスフェクション細胞の両方で検出されたことである。

表2.二価のBioNTechバイアルGH9715でトランスフェクションしたHEK293細胞株の特定の画分におけるスペクトルカウント数（タンパク質量）。

試験したバイアルのRNA濃度はBioNTechの申告値と一致する

トランスフェクション反応で使用したロットの品質を確認するため、Qubit RNA High Sensitivity AssayでバイアルのRNA含有量を試験した。その結果、バイアルには、臨床用量あたり30 µgのRNAが含まれていることが確認された（図2A）。3回の分析を行ったところ、ロットFD7958のRNA含有量は、推定臨床用量あたり26.74 + 0.31（平均値 + SEM）µg RNA、ロットFE6975は28.57 + 0.22 µg RNA 、ロットEX8679は26.51 + 0.59 µg RNA、ロットHD9869は28.12 + 0.47 µg RNAであり、臨床用量当たりで、本研究で使用された取り扱いおよび核酸定量方法の信頼性の高さを示している。

図2. 異なるBNT162b2生物製剤のRNAおよびDNA含有量。A: 臨床用量当たりのmodRNAのレベルは、Qubitによりバイアル内で測定された。n=3、平均±SEM。B-C: 異なるバイアル内の臨床用量当たりの二本鎖（ds）DNAのレベルは、RNase A処理なし（図B）およびRNase A処理あり（C）で、Picco Green（P）、Qubit（Q）、AccuBlue（A）により測定された。破線は生物学的製剤における二重鎖DNAの許容レベルを示すEMAの制限値である。 n=3、平均±SEM。 D: バイアル内の二重鎖DNAとRNAの含有量の比率と、EMAの規制（1mgのRNAあたり0.33mgの二重鎖DNA）を超える限界値（破線）。 SEM、平均の標準誤差。

試験対象のRNAワクチンロットには大量のDNAが検出された

BNT162b2ロットの残留DNAに関する報告書[27]を受け、本研究で使用した4ロットすべてについて、DNAプラスミドと大腸菌発現システムを使用した製造プロセスに起因する可能性のある残留DNAを検出するために、3種類の異なる方法で分析を行った。3つのDNA定量システム、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay（P）、Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay（Q）、AccuBlue dsDNA High Sensitivity Assay（A）を、元のワクチン溶液に直接適用した。結果は図2Bに要約されている。

予備試験では、バイアル中の脂質ナノ粒子を開き、存在する全二重鎖DNA（遊離型および脂質ナノ粒子に内包されたもの）の量を定量化するために、1%のTriton-X-100を適用した。表3に要約されているように、未処理のオリジナルサンプル中の二重鎖DNA含有量は、Triton-X-100で処理したアリコートと比較すると、明らかに低かった（バッチによって1.6～6.7倍）。以降の実験はすべて、Triton-X-100処理を施したサンプルを用いて実施した。

表3. RNase A処理前、Triton-X-100処理なしおよび処理ありのBioNTechバッチの指定バイアルにおけるDNAレベル。ファクターは、Tritonで破壊された脂質ナノ粒子から核酸が放出された際のDNAの増加を表す。SEMは、平均標準誤差を示す。

RNaseフリー緩衝食塩水で1:10に希釈したバイアルの内容物を1%のTriton-X-100で直接分析したところ、1回の臨床投与あたり1326～4225 ngの二本鎖（ds）DNAの高濃度が明らかになった。AccuBlue法では、3つのロットで最も低いDNA濃度を示し、FE6975ロットではQubit法と同じ濃度を示した。4つのロットのうち3つ（FE6976、EX8679、HD9869）については、Pico Greenアッセイが最も高いDNA濃度を示したが、ロットFD7958については、QubitアッセイがPico Greenアッセイよりもわずかに高いDNA濃度を示した。ロット内および測定方法における内部変動は最小限であり、取り扱いエラーを排除し、結果の頑強性を確認した。3つの異なる分析システムを比較したところ、それぞれのロットにおけるDNA濃度に、一部類似した部分と、より大きなばらつきが見られ、異なる分析方法で結果を比較する際の重要な側面が示された。

使用したキットが、dsDNA専用であるという主張に反して、高濃度のRNAが存在する場合にはRNAを部分的に検出する可能性を排除するために、図2Bで以前に測定した同じサンプルをその後RNase Aで処理した（表4）。3分以内にDNAの数値は劇的に低下し、その後30分間のインキュベーションの間は安定した数値を維持した。これは、a) インターカレーター色素が実際にRNAと反応し、b) RNase処理によって干渉するRNAがすべて十分に削除され、処理の終了時にはサンプル中にRNAが残っていないことを示唆している。今回も、独立して分析された3つの複製サンプル内の変動は最小限であった。未処理サンプルでAccuBlueを使用した測定では、最も低いDNAレベルが示され、RNase-A処理では、使用した3つの試験システムの中で最も低いRNAとの相互作用を反映して、最も高い含有量が示されたことは興味深い。AccuBlueは、DNA濃度を測定する際に、RNAとの交差反応が最も少ないことを示しているように思われる。これは、他の研究者による観察結果とも一致している[34]。このデータから、RNase-A処理後に得られたDNA値は、干渉RNAなしでバイアル内の実際のDNA濃度を表していると推測できる。この「純粋」な個々のバイアルの残留DNAは、臨床用量あたり32.71 ng～43.38 ngであった（図2C）。これは、1mgのRNAあたり1.23µg～1.62µgの二本鎖DNAに相当し、欧州医薬品庁（EMA）の上限値を4～5倍上回っている（表2；図2D）。

表4. RNase A処理前後のBioNTechロットの指定バイアルにおけるCRNAおよびDNAレベル（Triton-X-100処理後）。因子は、1mg RNAあたり0.33ugのdsDNAというEMA規制に基づく制限値を超える倍数を表す。SEMは平均標準誤差。

残留DNAにはプロセス関連のプラスミド要素が含まれ、細胞に取り込まれる

バイアル瓶で発見されたDNAが、mRNA製造プロセスで使用されたプラスミドDNAに由来するものであるかどうかを判断するために、プラスミドの全体マップを表す様々な遺伝子（SV40プロモーター/エンハンサー、ネオマイシンカセット、ORIレプリコン、スパイクタンパク質）の配列に対してプライマーペアが生成された（図3A）。ロットGH9715を含むバイアルは、このロットのプラスミドDNAがすでに単離および配列決定されており[21,22]、プラスミド配列BNT162b2（GenBank PP54 4445.1、GenBank PP544446.1、GenBank MQ287666.1は、BioNTechが発表した特許WO2021214204の配列16を表す）である。McKernanは、同定されたDNAが、mRNAの生産プロセスに必要なプラスミドDNAであることを証明することができた。 陽性コントロールでは、すべてのプライマーペアに対して正しいサイズのDNA断片が示された（図3B）。 陰性コントロール（水）では、シグナルはまったく示されなかった。 興味深いことに、1:10に希釈して検査した4つのバイアルすべてにおいて、異なる遺伝子のすべてのDNA断片に対して強いシグナルが示された。

我々のシステムにおけるHEK293細胞がワクチンRNA（証明済みのスパイク発現をもたらす）のみでなく、残留プラスミドDNAでもトランスフェクションされたかどうかを調査するため、慎重に洗浄および単離したトランスフェクション細胞からDNAを単離および精製した。図3Bに示されているように、4つのロットすべてについて、トランスフェクション後の細胞における調査対象のプラスミド遺伝子を表す正しいサイズのすべてのPCR産物を検出することができた。プラスミド内のカセット状に連結した72bpのSV40プロモーター/エンハンサーエレメントの2コピー（GenBank PP544446の領域1041-1185塩基；図3C）と一致して、SV40プロモーター/エンハンサーのPCRでは、予想されるサイズの2つの増幅産物が得られた（図3D）。これらの陽性シグナルは、通常PCR反応に使用されるDNA量の1～10%の量でも検出可能であった（図3B）。

図3Aおよび3B

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、modRNA製造プロセスで使用された完全なプラスミドの残留DNAが明らかになる。A: BioNTechがmodRNA製造のテンプレートとして使用したDNAプラスミドの概略図。特定の配列（SV40プロモーター/エンハンサー、ネオマイシン耐性カセット、ORIレプリコン、スパイクタンパク質）は色付きで強調表示されており、これらの遺伝子を検出するために使用される配列も同様に強調表示されている。これらの遺伝子には1から7までの番号が付されている。B: （図A、1-7）は、バイアル内のDNAプラスミド（右、PCRにロードする前に1:10に希釈）およびこれらの生物学的製剤でトランスフェクトした細胞からのプラスミド調製物（左）から、すべての遺伝子が検出されたことを示している。Mockは左側のネガティブコントロールとしての非トランスフェクト細胞、右側のネガティブコントロールとしての水を示す。ロットGH9715はポジティブコントロールとして使用された。

図3Cおよび3D

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、modRNA製造プロセスで使用された完全なプラスミドの残留DNAが明らかになる。C: SV40プロモーター/エンハンサー領域のマップには、逆プライマーの2つの結合部位とフォワードプライマーの単一結合部位の組み合わせにより、PCRで2つの増幅産物が可視化される72bpの要素の2つのコピーが示されている。D: SV40プロモーター/エンハンサーの追加PCR（図3Bと同じPCR条件で、ランタイムを長くしたもの）により、165bpと93bpの2つの増幅産物をより分離して視覚化する。

考察

ドイツで配布された4本のBNT162b2（Comirnaty）バイアルの核酸含有量を分析したところ、RNA濃度が臨床用量あたり30 µgという製造業者の仕様と一致しており、我々の分析の正確性が証明された。さらに、McKernanら[21,22]が米国ファイザー社のロットについて報告した量と同程度のプラスミドDNAを含む残留DNAを同定した。本研究で分析したバイアル中のDNA濃度は、RNase消化によりRNAを除去した後、1回分の投与量あたり32.7～43.4 ngであった。これは、WHOが注射用生物学的製剤で許容できると宣言している1回分の投与量あたり10 ngという最大上限値をはるかに上回っている[35]。

バイアル内に存在する総DNA含有量を分析できるようにするため、我々はTriton-X-100処理を行い、脂質ナノ粒子を開口させた。未処理のワクチン溶液とトリトンX-100処理したペアのアリコートを比較したところ、DNA含有量が1.6倍から6.7倍に増加した。これは、おそらく製造工程におけるDNA残渣の脂質ナノ粒子充填における高いばらつきを反映している。我々の結果は、最近、1つのComirnatyバッチで脂質ナノ粒子の開口後にDNA含有量が明確に増加したことを報告したRaoultのデータと一致している。本研究で分析した、トリトン-X-100による処理で脂質ナノ粒子から放出された残留DNAの量は、最近報告された量よりも少ない[27]。これは、RNAとインターカレーター色素の交差相互作用によるものかもしれない[37]。実際、サンプルをRNaseで処理すると、DNA濃度は著しく減少したが、それでも裸のDNAとして許容される限界値を何倍も上回るレベルであった。最近のプレプリント版論文[38]では、BNT162b2に含まれる製品由来のDNA不純物が、承認済みのmRNAの仕様と一致していることが報告されている。しかし、著者はQubit分析の前に追加のエタノール沈殿ステップを実施しているが、これは製造工程におけるDNase消化後のDNAの大部分を占める短いDNA配列を非効率的に沈殿させることが知られている。このアプローチにより、Comirnatyの2つのバッチで算出されたRNA量のバッチ内変動が大きくなった。我々の結果（エタノール沈殿なし）では、バッチ間のばらつきはわずかであり、RNA含有量はほぼ同一で、1回分あたり30 µgと指定された含有量とほぼ同じであったが、Kaiserら[38]によるRNA含有量の計算値ははるかに低く、1回分あたり最大20 µgであった。これは、おそらくサンプル調製中にかなりの量の核酸が失われたことを示唆している。結果として得られたRNA濃度が低かったのと同様に、DNA分析でも濃度が低すぎることが判明した。これは、沈殿、洗浄、分離ステップの損失が発生する前のバイアル（脂質ナノ粒子に封入する前）における初期のDNA濃度と比較すると、実際の残留DNA濃度を表していない。

注目すべきは、生物学的製剤中の残留DNAの公式な限界値は、抗体、弱毒ワクチン、およびタンパク質溶液に対しては定義されているが、RNA注射剤に対しては定義されておらず、さらに重要なこととして、脂質ナノ粒子のようなトランスフェクション試薬にパッケージ化された核酸に対しては定義されていないことである。実際、そのような注射剤において残留DNAの安全レベルを定義することを許可する科学的根拠は存在しない。

さらに懸念されるのは、製造プロセスにおける発現システムとして採用されたプラスミドDNAが残存するBNT162b2ロットの遺伝子配列が特定されたことである[9]。もともと、無傷のプラスミドの存在は、McKernan 氏らによって形質転換実験で実証されていた。すなわち、プラスミドによってコードされたカナマイシン耐性が受容体大腸菌に付与されたのである。しかし、ヒト細胞へのトランスフェクションも起こりうるのではないかという補足的な疑問は、まだ解明されていない。任意の追加のトランスフェクション試薬を使用せずに細胞培養をトランスフェクションした後、カナマイシン遺伝子やSV40プロモーター/エンハンサーのようなプラスミド由来の配列が、トランスフェクションされた細胞から再分離された。これは、脂質ナノ粒子へのパッケージングと細胞へのトランスフェクションが起こったことを示唆している。なぜなら、パッケージングされていない遊離DNAは細胞に取り込まれないからである。したがって、細胞内への取り込みは、プラスミドDNAの急速な分解と廃棄に続くものではない。残存するプラスミドDNAが細胞内で機能性タンパク質の生成のためのテンプレートとして機能する可能性があるかどうかを明らかにするにはさらなる調査が必要であるが、我々の結果は、RNA生物製剤に含まれる残存プラスミドDNAおよびその断片が、ヒトのレシピエントの無数の細胞に侵入することは疑いの余地がないことを示している。しかし、トランスフェクトされた細胞の一部に完全なプラスミドが含まれているかどうかは証明できなかったが、同定されたSV40プロモーター/エンハンサー領域の存在は、プラスミドの有無に関わらず非常に懸念される[23,40,41]。

我々の分子分析により、McKernanらによって報告されたデータ[21,22]、すなわちSV40プロモーター/エンハンサーのDNA配列の存在が確認された。この配列は、BioNTech/Pfizer社が承認手続きで提出したプラスミドマップでは宣言されていなかった[42、24ページ]。この発見は非常に驚くべきものであり、正当な疑問を提起する。なぜBioNTech/Pfizer社は、全く必要のないにもかかわらず非常に危険なこの要素をプラスミドに組み込み、それをmodRNAの生産のためのテンプレートとして使用したのか？我々の意見では、BioNTech/Pfizer社は、この非常に危険な要素をプラスミドに組み込んだことについて、責任を問われるべきである。

設計上、BioNTechとPfizerが使用しているプラスミドはいわゆるシャトルベクターである。これらはクローニング部位とポリアデニル化シグナル、そしてT7ファージプロモーターのような細菌系での複製と翻訳に必要な要素、さらに真核細胞での転写開始を可能にするためのプロモーター/エンハンサー要素（通常CMVやSV40のようなウイルス由来）を含んでいる。現在のBioNTech/Pfizerのプラスミドの原型となった最初のシャトルベクターの1つは、早くも1988年に確立された [43]。同様のSV40構成要素を含む哺乳類発現ベクター [Addgene: pcDNA3.1 SARS-CoV-2 S D614、ただし細菌構成要素なし] は、2020年にはすでにヒト細胞株におけるスパイクタンパク質の機能解析に使用されていた [44]。

スパイクタンパク質をコードするRNAの公式な生成プロセスによると、プロセス2全体が細菌のE. coliシステムで試験管内で行われるため、真核生物のプロモーター/エンハンサーは必要ない。さらに、CMV、バキュロウイルス、RSVなどの利用可能な強力なウイルスプロモーター/エンハンサー要素の中でも、SV40要素は、RNA生物学的製剤の開発に先立つかなり以前から、72bpのSV40プロモーター/エンハンサー断片がトランスフェクト細胞の核へのプラスミドDNAの最大輸送を促進することが示されているため[23,41]、標的細胞の完全性にとって最も危険である。この特徴はCMVやRSV要素には見られない。具体的には、ディーンら[23]が警鐘を鳴らしている次の点が挙げられる。「非ウイルスベクターにこのSV40配列が含まれると、特に非分裂細胞において、核内への輸送能力が大幅に高まる可能性がある」というものである。SV40プロモーター/エンハンサーエレメントを含むプラスミドの核内への輸送は、試験された広範な種類の細胞で確認されており[45]、効果の高い遺伝子治療アプローチのためのSV40プロモーター/エンハンサーエレメントの促進につながる。SV40プロモーター/エンハンサー配列が検出されたことで、製造者が製造プロセスに純粋な原核生物発現システムを選択するのではなく、この哺乳類細胞活性要素を含む発現システムを選択した意図が問われる。

最後に、トランスフェクション細胞がスパイクタンパク質を産生し、分泌できることを証明する。トランスフェクションには、他のトランスフェクション増強物質は一切使用していない。これにより、ワクチン接種を受けた個体の状況を模倣した、リピッドナノ粒子を「トランスフェクション試薬」として用いた純物質の直接遺伝子導入を、宿主細胞で分析することが可能となった。アポリポタンパク質E3（ApoE3）のようなトランスフェクションエンハンサーを追加投与すると、LNPの脂質エンベロープのコレステロールと結合し、ApoE3受容体を介して細胞内へのLNPの取り込みが促進されるため、トランスフェクション効率が向上することが知られている。また、標的細胞株を変更したり、脂質ナノ粒子の投与量を増やすことでも、トランスフェクション効率を高めることができる。したがって、細胞内および細胞外のスパイク濃度の測定値は、方法のセクションで詳細に説明されている特定のパラメータ下におけるHEK293細胞のみを指す。トランスフェクション後、我々の細胞は、modRNAを含む脂質ナノ粒子の取り込み後に細胞の健康状態が損なわれたことを示す大きな細胞内小胞を示した。後者のエンベロープは4つの脂質成分で構成されている。特に、カチオン性（イオン化可能）脂質のグループは、in vitro および in vivo において細胞に毒性および炎症促進効果をもたらすことが知られている [46]。 体内のどの程度の数の、また、どのタイプの細胞が影響を受けるのかは現在のところ不明であるが、脂質ナノ粒子が全身に広がり、modRNA が検査したすべての臓器で検出されたことが報告されている [9]。我々は、スパイクタンパク質の生成が数日間続くことを確認した。24時間後にはmodRNAの最高レベルが予想されるが、分解される前に、1週間後には24時間後よりもさらに多くのスパイクタンパク質が細胞内に存在する。スパイクタンパク質の生成量はロットごとに異なっていたが、時間経過による進行はすべて同一であり、トランスフェクション後5日目にピークに達した。また、ロットHD9869は他の3つのロットよりも有意に低いスパイクタンパク質レベルを示していることから、生産量は注入されたmodRNAの量と関係していることも示された。これは、HD9869が2つの異なるスパイクタンパク質変異体、すなわち武漢変異体とオミクロン変異体に対する2つの異なるmodRNAで構成される2価ワクチンであることが原因である。今回使用したELISAは武漢株のみを検出するため、オミクロン株由来のスパイクタンパク質は検出されず、武漢株のみの3価ワクチンよりも低い値が得られた。

質量分析法を用いることで、スパイクタンパク質がほぼ完全にエキソソームを介して培地中に放出されることを証明することができた。生体内で起こっている場合、これはスパイクタンパク質がエキソソーム内で血流を介して他の組織や臓器に運ばれ、その結果、標的細胞に取り込まれることを意味する。実際、ワクチン接種を受けた個人のエキソソーム内にスパイクタンパク質が存在することがすでに報告されている[10]。エキソソームの機能は多様である。主に、同じ組織の細胞間、または異なる組織の細胞間のコミュニケーションのプラットフォームとして機能する。エキソソームは、さまざまなメカニズムにより標的細胞に容易に取り込まれ、その内容物が標的細胞に入り込み、構造的および機能的な反応を引き起こす[47]。BNT162b2の場合、脂質ナノ粒子やモルフォリノRNAの存在に関係なく、このようにしてスパイクタンパク質が1つの組織から次の組織へと伝達され、取り込まれる可能性がある。スパイクタンパク質を含むエクソソームの取り込みにより標的細胞が損傷を受けるかどうかは、まだ調査されていない。しかし、この強力なトランスフェクション能力は、共トランスフェクトされた残留DNA、特に一次材料であるプラスミドのSV40プロモーター/エンハンサー要素という背景を考慮すると、警鐘を鳴らすものである。予備実験では、別のロットのBNT162b2が卵巣がん細胞に遺伝子導入され、実際に、全ゲノムシーケンスにより、遺伝子導入された核酸物質の一部が細胞の染色体9および12に組み込まれていることが確認された[48]。

modRNAの配列から、スパイクタンパク質を小胞体腔に翻訳するためのリーダー配列と膜アンカー配列がmodRNAから除去されていないことがわかる。その結果、生成されたスパイクタンパク質は主に細胞表面で発現される。BioNTech社によると、modRNAは細胞質で翻訳される[49]。これは、スパイクタンパク質が細胞内に留まり、細胞表面に全長タンパク質として提示されないことを意味する。しかし、これは他の膜タンパク質におけるRNA内のリーダー配列とアンカー配列の機能と矛盾する。また、BioNTech社はスパイクタンパク質の遊離の可能性についても考慮していない[49]。

本研究の限界とデータのばらつき

結果を再現し、ばらつきを特定するために、技術的および生物学的複製（適切な場合）を使用した。各実験のばらつきはグループ内で小さかったため、技術的アーティファクトは除外できる。我々は少数のロットにしかアクセスできなかったが、「RNAワクチン」による残留DNAと細胞トランスフェクションの根本的な問題を実証するには十分であると考えた。実験が実施された2023年には、メーカーが指定した3つの単価ワクチンロットの有効期限はすでに切れていた。バイアルは常に未開封の状態で-80℃で保存されていたこと、また有効期限はドイツのポール・エーリック研究所（PEI）によって公式に数回延長されていたこと（50: 10. 2021年9月は6～9ヶ月に延長、51: 2022年3月/4. 4月は9～12ヶ月に延長、52: 2022年12月は12～18ヶ月に延長）から、私たちは何らかの悪影響が出ることはないと考えている。2022年3月/4月 9ヶ月から12ヶ月に延長、52: 2022年12月 12ヶ月から18ヶ月に延長]、当社の業績に悪影響が及ぶことはないと考えている。ワクチンには、一本鎖のmodRNAやベクターベースのDNAに加えて、安定した二本鎖RNA（dsRNA）やRNA:DNAハイブリッドも含まれている可能性を排除することはできない。また、異なる細胞タイプに対する脂質ナノ粒子の毒性を完全にマッピングすることもできない。我々の実験では、不死化されており、ある程度の毒性物質に耐えることができる比較的頑強なヒト胚腎細胞株を使用した。例えば、初代神経細胞や免疫細胞などの初代培養細胞は、脂質ナノ粒子に対してより敏感に反応するため、さらなる研究が必要である。脂質ナノ粒子が全身に分布し、おそらくはすべての細胞タイプに影響を及ぼすことが知られているため、毒性、発現挙動、プロテオーム解析に関するさらなるin vitro研究を実施しなければならない。

結論

ヒト細胞株HEK293への4種類の異なるBNT162b2ロットのトランスフェクションにより、数日間にわたってスパイクタンパク質が産生され、エクソソームを介して細胞上清中に放出されることを実証した。すべてのバイアルに、EMAが認める1mg RNAあたり0.33 ng dsDNAという許容値をはるかに超える濃度で、残留プラスミドDNAが検出された。すべてのプラスミド遺伝子と、SV40プロモーター/エンハンサー要素の2つのコピーを特定した。DNAは細胞内に入り込み、持続することが示された。

政府による予防接種キャンペーンが始まる前から、医師や科学者たちは、遺伝子ベースのワクチンが深刻な副作用を引き起こす可能性を指摘していた。 その一方で、副作用の症状は多岐にわたるようになり、この新しい複合疾患を指す「スパイク病」という用語も生み出された[53]。 RNA生物学的製剤の永遠の危険性は4つある。

• 第一に、外来タンパク質をコードするmodRNAは有害な自己免疫反応を引き起こす。
• 第二に、脂質ナノ粒子自体が非常に毒性が高い。
• 第三に、残留プラスミドDNAと逆転写されたmRNAが細胞を遺伝的に改変する。
• 第四に、天然のmRNAにおけるウリジンが合成modRNAにおけるN1-メチル-シュードウリジンに置き換わることで、リボソームのフレームシフトが+1となり、全くの異質なタンパク質がランダムに生成される。

我々の結果は、これまでに発表された報告を裏付け、さらに拡大するものであり、BNT162b2ワクチンの安全性について重大な懸念を提起するものである。これらの懸念が科学的に検討され、説得力を持って払拭されるまで、すべてのRNAベースの生物学的製剤の即時中止を求める