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AQUATIC TOXICITY TESTS WITH SUBSTANCES THAT ARE POORLY SOLUBLE IN WATER AND CONSEQUENCES FOR ENVIRONMENTAL RISK ASSESSMENT
環境毒性化学, Vol.31, No.7, pp.1662-1669, 2012
(2011年9月2日提出，2011年11月29日修正返却，2012年3月4日受理)
概要
水に溶けにくい物質の水生毒性試験は，さまざまな方法で行われており，それに応じて毒性の推定値も異なっている。本研究では，試験デザインや溶液調製法の違いによる毒性値の違いを明らかにし，これらの試験を実施するための最適な方法を提案した。また，環境リスク評価や分類に与える影響についても考察している。本研究では，主に植物防護製品の有効成分を対象としているが，その他の化学物質にも関連があると考えられる。毒性試験は飽和限界までしか実施せず、分散剤は避け、溶媒は取り扱いや溶解速度をサポートするために必要な場合にのみ使用することが推奨されている。曝露濃度の分析測定は、生物が曝露される内容を反映したものでなければならない。飽和限界での急性毒性試験で悪影響がない場合、通常はさらなる試験を必要とすべきではない。エンドポイントの毒性値を飽和限界とみなし、有害な分類を必要とすべきではない。慢性試験が必要な場合は、最も現実的なワーストケースの暴露シナリオである実用的な飽和限界で実施すべきである。有害事象が発生しなければ、より高い水への曝露は起こらないため、リスクは許容できるはずである。これは、追加の生物種を試験することで立証できる。飽和限界における無影響濃度（NOEC）の評価因子については，規制上の許容濃度が不必要に低くならないように、リスク評価において慎重に検討する必要がある．Environ. Toxicol. Chem. 2012;31:1662-1669. # 2012 SETAC
キーワード-水溶解度限界 溶剤 分散剤 植物保護製品 リスク評価
はじめに
水に溶けにくい物質を用いた水生生態毒性試験は様々な方法で実施されており、結果として得られるL(E)C値（致死[またはその他の影響]濃度）は大きく異なる場合がある。規制対象となる水生生態毒性試験において、被験物質の溶解を助けるために溶媒や分散剤を使用することは、これまでに相反するガイダンスが存在した分野であり[1-4]、各試験ガイドラインが独自の推奨事項を定めていることもあり、さらに複雑である。しかし、試験溶液の調製方法や試験容器への導入方法、溶解しなかった被験物質の処理方法が、試験結果や信頼性に大きな影響を与えることは一般的によく知られている。また，影響データを分析濃度値として表現することや，その生成方法についても慎重に検討する必要がある。本研究では，除草剤であるジフルフェニカンを例に，水に溶けにくい物質を用いた特定の試験方法（溶液の調製および試験の実施）と結果として得られる毒性値との間に見られる差異を示し，特に植物防護製品に関連する規制水生生態毒性試験の実施および報告のための調和のとれたガイダンスを提供している。
背景に関する考察
水生生態毒性試験の目的は、水溶液中、すなわち試験媒体に溶解した状態の物質の 毒性を判定することである（なお、懸濁液や乳濁液として放出することを目的とした物質 や製剤は本研究の対象外である）。これは、一般的に物質の溶解した部分のみが生物学的膜を越えて取り込まれ、移動するために生物学的に利用可能であり、したがって真の水生毒性の原因となるために提唱されている[5]。試験媒体中に存在する未溶解物質は、本質的な物質の毒性とは無関係に、試験生物に有害な（物理的な）影響を及ぼす可能性がある[2,3]。この例として、魚類の鰓膜の閉塞、ミジンコの包埋・侵入、藻類試験における光強度の低下などが挙げられる。また、溶解していない粒子を経口的に摂取すると、消化管内で物質が放出され、その後、毒性を引き起こす可能性がある。結果の解釈において、溶解度限界を超えた試験による影響を考慮することは可能であるが、実際にはそのような影響は本質的な物質の毒性とは容易に区別できず、試験結果を混乱させる可能性がある。さらに、被験物質の水溶性をはるかに超える試験濃度には、より溶解性の高い不純物が含まれる可能性があり、その影響も真の物質毒性の解釈を混乱させる可能性がある。その結果、特定の被験物質について、過剰な未溶解物質を含む水生試験の結果は、試験媒体の準備やサンプリングの方法に応じて著しく変化する可能性がある。この変動性は、ナノ材料の水生毒性試験でしばしば観察され、現在、集中的な研究対象となっている[6-8]。未溶解物質を用いた試験による影響濃度は、本質的な物質の毒性を誤って解釈する可能性があるため、そのような試験は規制上の決定を下すのに不適切な場合がある。ただし、溶解度が低く、溶解した濃度を測定することが不可能な物質を用いた試験や、交絡する（物理的）影響を排除できる場合は例外である。
濃度を確認するための分析的な測定は、水生試験、特に規制試験においてしばしば行われ、サ ンプリングと準備の方法は、試験のエンドポイント推定値の大きさと有用性に大きな影響を与える可能性が ある。例えば、現在、化学分析の前に溶液をろ過または遠心分離して、未溶解分（例えば、糞、試験生物の抜け殻、または試験生物全体（例えば、藻類）を含む）を除去することが推奨されている[1-4]。しかし、過去には必ずしもこのようなことは行われておらず、その結果、試験濃度は被験物質の溶解度限界を超えているが、公称濃度の合理的なパーセンテージの範囲内で許容できる分析結果が得られている。
場合によっては、原液の調製を助けるために溶媒の使用が正当化されることもある。場合によっては、被験物質の安定性を高めるため、あるいは被験物質や露光装置の過度な超音波処理を避けるために、溶媒を使用することが望ましいこともある。しかし、被験物質又は試験系（被験生物＋曝露系）との相互作用により、試験における反応が変化する可能性があるため（例えば、Stratton [9]）、溶媒の使用は、他に許容できる媒体調製法がない場合に限定すべきである。水混じりの溶媒で調製したストック溶液は、試験媒体に加えて混合するのに適しており、したがって、水溶解度の低い物質の飽和溶液の前処理を促進するのに役立つ。溶媒を加えても，それ自体が水への溶解度を高めるわけではない。しかし，水／溶媒溶液の飽和限界は，純水への溶解度よりもある程度大きくなる可能性がある。しかし、飽和限界を超えた量は、ストックを試験媒体に添加して溶媒濃度が希釈されたときに沈殿し、試験生物に悪影響を及ぼす可能性がある（上記参照）。したがって、沈殿物は試験生物の添加前に除去する必要がある。考慮すべき物質固有の分析的側面がさらにあることに留意しなければならない。例えば、疎水性の物質の中には、ガラス器具、フィルター、および遠心分離管に吸着する傾向があり、サンプルの調製を困難にし、液体物質は遠心分離またはろ過のいずれにも適さない場合がある。溶媒の量を最大推奨レベル（0.1ml/L）以上に増やすことは、試験生物に対する毒性など、試験システムに影響を及ぼす可能性があるため、推奨されていない[2,3]。また，溶媒は，試験容器内での微生物の増殖を促進する炭素源となり，試験生物から溶存酸素を奪ったり，pHシフトを引き起こしたり，微生物膜内に生物を取り込んだり，被験物質の分解や吸着を促進したりする可能性がある。
水生生態毒性学において一般的に使用される溶媒とその水生生物に対する毒性は、欧州生態毒性学・化学物質毒性学センターの文書に記載されている[3]。これらの溶媒は全て水生生物に対する急性毒性が低いが、これが選択の唯一の根拠ではない（以下の提案の項を参照）。
試験方法の影響に関するケーススタディ
試験溶液の調製における可溶化剤の使用と過剰な被験物質の存在に関連する潜在的な問題を説明するために，登録者の許可を得て，欧州連合の審査プロセス[10]から除草剤ジフルフェニカンのデータを選択した。この物質の水生毒性エンドポイントの値を表 1 にまとめた。L(E)C50値(50%致死[または効果]濃度)は，試験濃度の分析がない場合(および1%の分散剤を使用した場合)，あるいはフィルタリングされていないサンプルを分析した場合に最も高かった。ジフルフェニカンの水溶性限界は約50mg/Lで、温度、pH、試験媒体、水の硬度によってわずかに変化する。古い試験（1984/1985）では，分散剤と溶剤を組み合わせて使用した場合，溶解度限界を大幅に超える105,000 mg/LまでのL(E)C50値が報告されている。魚類およびミジンコを対象とした新しい試験（1997/1999）でも、溶解度限界を超える結果が報告されている。魚類ではジメチルホルムアミドを溶媒として用いた場合に109 mg/Lまで、ミジンコでは特定されていない溶媒を用いた場合に240 mg/Lを超え、「水溶解度の目視限界を超える[10]」と報告されている。これらの新しいL(E)C値がリスクアセスメントに用いられた。藻類試験のみが溶解度限界以下の値を示しているが，これは本サブスタンスが除草剤として予想されるように藻類に対して高い毒性を持つためである。以下の考察では，特定の試験条件および特定の試験媒体での溶解度限界を指していることを明確にするため，溶解度限界ではなく「飽和限界」という用語を使用しているが，これは報告されている純水での溶解度限界とは異なる可能性がある。
ジフルフェニカンの結果の大きさの範囲は、可溶化剤（溶媒を使用したか否か、溶媒と分散剤を併用したか）、未溶解の被験物質の存在と処理（過剰な物質が存在しない（飽和限界以下の試験）、過剰な物質が存在する（飽和限界以上の試験）、未溶解の被験物質を含む試料から濃度を測定した（すなわち、未溶解の画分を分離せずに測定した）、などによって説明される。または、過剰な物質が存在するが、被験物質の濃度は溶解した画分のみに基づいて分析的に決定された（すなわち、ガイドライン[1-4]の推奨）。
最後の選択肢（すなわち、過剰な物質が存在するが、溶解した画分のみに基づいて分析的に決定する）を除いて、上記のすべてのシナリオがジフルフェニカンの試験で使用され、魚類およびミジンコの試験結果のばらつきの直接の原因となった。対照的に、藻類試験では、飽和限界以下で試験が行われたため、各クラスの藻類に対して非常に一貫した結果が得られ、これらの試験では、溶存物質の真の毒性が確認された。この例は、溶解度限界以上で試験を行った場合、試験方法の違いによってL(E)C値が全く異なる結果になることを示している。ジフルフェニカンの場合、藻類のエンドポイントがリスク評価を左右するため、これは重要ではない。しかし、他のケースでは、不正確で不規則なL(E)C値が使用され、重大な結果を招く可能性のある毒性を誤って表現する可能性がある。
溶解度限界での試験がもたらす規制上の影響
植物保護製品に対する既存の規制要件を検討すると、場合によっては、溶解度限界（実際には、特定の試験条件下での飽和限界）までしか試験を行わないことが、（誤って）溶解度限界以上の試験を行い、その結果を溶解した画分の濃度に基づいて表現しない場合と比較して、登録者に不利になるのではないかという疑問が生じる。例えば、試験した用量レベルが100mg/L未満であっても、生物に影響を与えたり、正確なL(E)C50値を推定したりするのに十分な高さではない場合、米国環境保護庁（U.S. EPA）[11]によって試験が補足的なものとしてリストアップされることがある。これは、溶剤や分散剤の使用を促し、登録者に飽和限界以上の毒性効果を実現させ、さらに重要なことには、非溶解画分を含む測定濃度に基づいてL(E)C50を報告させるものである。これとは逆に、米国EPAの難解な物質の試験に関する独自のガイダンス[1]によれば、試験したレベルで溶解性が問題となった可能性が高く、沈殿物が形成された場合には、試験が却下される可能性がある。別の国の例では、オーストラリア・ニュージーランド環境保全協議会／農業・資源管理協議会のガイドライン[12]が、0.1 ml/Lまでの溶媒の使用を認めることを含め、方法論として経済協力開発機構（OECD）の試験ガイドラインを一般的に参照しているが、環境評価のためのエンドポイント毒性リストを導き出す際に、溶解性限界を大幅に上回るエンドポイント毒性値を持つ試験のデータ（例えば、ファクター＞2）を拒否している。OECDガイダンス文書[2]によれば、「『報告された』水溶性を超える暴露濃度は必ずしも無効とみなすべきではなく、ケースバイケースで検討すべきである。これらのガイドラインに厳密に従うと，L(E)C50値が水溶性限界以上，すなわち「飽和状態でも毒性を示さありません」ということになる[2]。この値が正確ではなく、最高試験濃度として推奨されている100 mg/Lの限界値を下回っていても、その物質が試験対象の生物に対して水中で急性毒性を示さないことを意味する。
水生生物のリスクアセスメントへの影響
理論的な物質輸送と希釈に基づいて暴露濃度を算出する環境リスクアセスメントにとって、これはどのような意味を持つのであろうか。例えば、水への溶解度が 50mg/L の農薬の場合、魚類、ミジンコ、藻類の L(E)C50 値がすべて 50mg/L を超え、近くの地表水で計算された事前予測環境濃度（PEC）が 120mg/L である場合（スプレードリフト計算に基づくため、水への溶解度に関係なく水に入る物質の量が得られる）、短期的なリスクは通常（現在）容認できないと考えられる。これにより、使用が拒否されたり、バッファーゾーンなどの制限が設けられたり、さらに高次の試験（動物福祉に影響を与える可能性がある）が行われたりする。しかし、この例では、算出されたPECは人工的なものであり、溶解度限界を超えているため、潜在的な溶存生物学的利用可能濃度を反映しているとは考えられない。また、実際には、標準的な試験種では、飽和限界において許容できない短期的影響はなかった。したがって、短期リスク評価におけるリスクの表示は誤解を招く恐れがある。
実際には，農薬活性成分は単独で散布されることはなく，製剤として散布される。製剤とは，活性成分と，製品の利用効率を高めるために設計された他の成分（多くの場合，分散剤や溶剤を含む）との複雑な混合物である。通常、製剤を用いた短期試験によるL(E)C50値が入手可能であり、この場合のリスク評価にはより適切である。欧州委員会のガイドライン[13]でも参照されているOECDガイダンス文書[2]では、「溶解度の低い化合物を扱うには、特に溶解度の限界で影響が生じない場合には、調合した製品を用いた試験も適切な方法であるかもしれありません」と述べている。環境中で物質が飽和限界を超えると、沈殿物が他の粒子状固体と一体化してしまう可能性が高い。そのため、水-堆積物系で試験を行うことも選択肢の一つである[13]。吸着または沈殿した物質の影響は、堆積物に生息する生物または底部を食べる生物を試験することで評価できる。いずれの場合も、脊椎動物を用いた追加試験が必要な場合は、考慮すべき動物福祉の問題がある。
OECDガイダンス文書[2]によれば、「飽和濃度で急性毒性の影響がないからといって、飽和濃度や低濃度で慢性毒性がないことを予測する根拠にはならないことに留意することが重要である。化学物質が飽和状態で急性毒性影響がないと予測される場合は、規制当局に相談することが推奨される。規制当局によっては、急性毒性試験を省略し、そのまま慢性毒性試験に進むことを好むかもしれない。後者は、欧州委員会の勧告にも沿ったものである[13]。欧州生態毒性・化学物質毒性センターの文書[3]では、初期リスク評価のために以下のような保守的なアプローチを提案している：「急性データに通常適用される評価係数を、測定された最も高い溶解性濃度（または溶解性限界）に適用するべきである。その結果得られた値を用いたリスク評価で、リスク特性比が不十分であると判断された場合には、その物質の慢性毒性を判定する必要があるかもしれありません。」これにより、従来の段階的な試験方法と比較して、試験対象となる動物の数が少なくなる。しかし、飽和限界での試験エンドポイント値に通常の評価・安全係数を適用すると、観察された生態 毒物学的影響に基づかない非常に低い規制上の許容暴露値になる可能性がある[14]。したがって、水に溶けにくい物質を用いた試験のエンドポイントに評価係数を用いること は慎重に検討すべきである。
同様のアプローチは、分類・表示についても既に提案されている。European Centre for Ecotoxicology and Toxicol-ogy of Chemicals [3]は，溶解度限界で毒性を示さない物質は分類すべきではないと勧告している。OECD [15]はこれをさらに明確にし、溶解度限界では毒性を示さないが、生物蓄積性が高く、「容易に生分解性を示す」という基準を満たさない物質については、デフォルトの予防的分類を行うか、溶解度限界での慢性試験を行って危険性があるかどうかを確認すべきだと勧告している。
しかし、欧州水枠組み指令では、環境品質基準（EQS）について次のように述べていることは注目に値する。この付属書で設定されたEQSは，全水試料中の総濃度で表される」[16]。EQSは水生生態毒性研究から導かれており、一般的に、エンドポイントでの毒性の推定値が低いほど、EQSは低くなる（すなわち、懸念が生じるまでにモニタリング対象の水域で許容される濃度が低くなる）。そのため、水に溶けにくい物質を飽和限界までしか試験しないことは、再び不利になる可能性がある。飽和限界以下での試験が正しく行われているにもかかわらず、モニタリングが総濃度で行われている場合、異なる測定単位間での非科学的な比較が行われることになるため、この状況は再評価されるべきであると考える。この場合、飽和限界を超えて試験を行い、同等の暴露指標を用いて EQS を導き出すことを正当化することができるかもしれないが、やはり脊椎動物の追加試験が必要となる場合には、動物福祉に影響を与えることになる。
提案
以下の提案は、既存のガイダンス[1-4]に基づいており、著者および謝辞を述べた同僚の経験に よって補完されている。
試験条件下での溶解度限界（飽和）について
毒性試験は、試験条件下での最大溶解濃度（すなわち、飽和限界）まで、あるいは、植物防護製品の精緻な評価の場合には、最大環境濃度まで（例えば、圃場から運ばれた水にさらされた生物を試験することにより）のみ実施すべきである。水に難溶性の物質の試験条件下での飽和濃度は、特定の試験条件（pH、温度、イオン強度、媒 体のキレート特性など）に応じて、報告されている水溶性（OECD ガイドライン 105[17]による二重蒸留水など）とは大きく異なる可能性がある。特に海洋試験媒体では、劇的な差が生じることがある[18]。非常に低濃度の分析結果は，曝露系のわずかな擾乱に影響されて大きく変化する可能性がある。また，極めて難溶性の化学物質の場合，水溶性や飽和濃度を実験的に決定するには，現在の分析技術では不十分である可能性がある。試験デザイン間の飽和濃度の違いは、溶出した被験物質の目標濃度を達成するためにあらゆる 合理的な努力が払われている限り、必ずしも無効と考えるべきではない。
水に溶けにくい物質や水溶液中での物理化学的挙動が不明な物質の試験条件下での最大溶存 濃度を決定するためには、OECD[2]が提案するように、試験条件を模擬した予備的な溶解性試験を実施し、 実験結果を報告する必要がある。溶解性試験では、溶解した濃度を含む真の試験溶液を保証するために、分析測定の前に分離ステップ（遠心分離またはろ過）を行う必要がある。
飽和した試験溶液を生成するための手段
溶媒は、被験物質の試験液への分散を促進する最も一般的な手段であり、水溶液的に 不安定な物質や粘性の高い物質の原液を調製する際には不可欠であるが、溶媒の使用はそれ自 体では試験液への溶解性を高めるものではない。被験物質の試験水への溶解性を高めるためには、他の手段が望ましい。溶媒の使用を避けるか、試験前に溶媒を除去するためにあらゆる努力をすべきである。例えば、揮発性溶媒（例えば、アセトン）に溶かした被験物質の原液を試験容器に直接加え、 蒸発させて被験物質の均一な薄層を残す方法[19]は、水のモルエキュールとの相互作用を最大化し、溶 解の速度を高めることができる。その他の手法としては、例えば、長時間の撹拌や高せん断混合、超音波処理、温度調整、pH 調整、飽和カラムなどのジェネレーターシステム、被験物質を過剰に添加するが不活性な担体基質（例：シリカゲル）に入れ、そこから溶解度限界に応じて水に受動的かつ連続的に移動させる新しいパッシブドージング法などがある[20,21]。手法の選択は、被験物質の物理化学的特性に基づいて行うべきである。溶けにくい液体物質の場合、未溶解物質や乳化物質を過剰に含まない飽和溶液を生成するには、液-液飽和ユニットが有効である[22]。溶媒の使用が避けられない場合には、溶解度の限界に近い溶液を生成するために、修正された希釈システムが成功している[23]。安定した被験物質の溶出濃度を含む真の試験溶液を得るために、あらゆる合理的な努力がなされるべきである。
溶解物質の測定値に基づく濃度
毒性試験の結果は、理想的には測定された溶存物質に基づくべきである。そうでなければ、 毒性が過小評価または過大評価される可能性がある。報告された」水溶性限界の原液に沈殿物が生じた場合、過剰な被験物質は被験体の曝露前に（例：遠心分離やろ過）分離する必要がある。しかし、溶解した物質は、フィルター[24]や遠心分離管への吸着など、分離技術によって失われる可能性がある。さらに、報告されている水溶性を超えて試験を行う場合、結晶、凝集体、ミセルなどは目視では容易に検出できないことがあるため、透明な試験液が真の溶液であると仮定してはならない。この点については、溶液にレーザー光を照射して、ティンダル効果を観察することが有効である[17,25]。理想的には，試験液ごとに分離工程を設けることで，未溶解の可能性のある物質を確実に除去することができるが，これは，特に大量の試験液を扱う場合には，必ずしも実行可能ではない。さらに、表面層、エマルション、ミセルを形成する未溶解物質の除去が困難な場合もある。試験デザインの変更や結果の適切な報告については、試験前に担当当局と協議する必要がある。
水溶性が非常に低い物質の場合、水溶液を直接分析することは不可能であり、溶媒中で 検出可能な濃度に調製した原液を測定することが選択肢となり得る。しかし，分析上の制約から実験的に求めた水溶解度の値が得られない場合，すなわち水溶解度が検出限界以下の場合には，水生生物毒性試験における上限濃度の参考にはならない。この場合、目標とする濃度が不明なので、溶媒の原液はほとんど役に立たない。水溶性計算機が利用可能であり（例えば、www.vcclab.org）、ある程度の指針を与えることができるが、計算された溶解度は実験的な飽和値とはかなり異なる可能性がある[14]。好ましい選択肢は、試験条件下で飽和溶液を生成するために飽和ユニットを使用することである[22]。分析による検証がなければ、試験結果は飽和溶液の割合に基づく公称値として提示する必要があり、飽和限界を推定するために利用可能な最善の計算と観察を用いる。毒性が予想されず、未溶解物質が試験生物に物理的影響を及ぼさない場合には、曝露中に 試験容器内に残留してもよいが、それでも結果は、上記のように入手可能な最善の方法で推定した飽和限 界に基づいて表現しなければならない。後者の場合、分析方法がない場合には、未溶解物の存在を、生物が飽和濃度に曝露されたことを経験的に示す証拠として用いることができる。場合によっては、メッシュなどの物理的な障壁を用いて、生物を未溶解の試験物質から分離することが可能な場合もある。
溶剤
ガイドラインに記載されている様々な溶媒のうち、トリエチレングリコールとジメチルホルムアミドが推奨されている。この2つの溶媒は，揮発性が低く，多くの有機物質を溶解する能力が高く，アセトン，エタノール，メタノールなどの生分解性の高い溶媒でよく見られる酸素欠乏の問題を軽減することができる[3]。この推奨は，著者らの実務経験に基づくものであり，現行のガイダンスでも支持されている[3]。しかし、溶媒の最終的な選択は、被験物質の特性および被験生物に対する溶媒の毒性に基づいて行うべきである。いくつかの典型的な溶媒の毒性値は，European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicalsの文書[3]およびHutchinsonらのレビュー[26]に示されている。
溶剤の濃度
溶剤を使用しなければならない場合、その濃度は短期試験では0.1ml/L、生殖試験や内分泌活性化合物を用いた試験では0.02ml/Lを超えてはならない（溶剤は0.1ml/L未満で生殖や内分泌撹乱のバイオマーカーに影響を与える可能性がある[26]）。その濃度は、試験種や毒性試験の長さ・種類に応じて、溶媒の無影響濃度（NOEC）の1/10以下であることが望ましいが[2]、溶媒の毒性に関するデータはすべての試験種や試験の種類で利用できるわけではない。これは，限界値が異なる個々の試験ガイドラインによって複雑になっている．例えば、OECDの魚類急性毒性ガイドラインでは、試験において最大100mg/Lの可溶化剤の使用が認められている[27]。これは、溶媒の関連質量がその密度に依存するため、OECD魚類初期生活段階またはミジンコ繁殖試験ガイドライン[28,29]やOECDガイダンス文書[2]の0.1 ml/Lとは同じではない。急性試験では0.1 ml/L、慢性試験では0.02 ml/Lという溶媒の濃度は許容範囲の上限を示しているが、どのような試験でも溶媒の使用量を可能な限り制限値以下に抑えるように努力すべきである。
溶剤の管理
試験液に溶媒が含まれている場合、溶媒の濃度はすべての処理と溶媒コントロールで同じでなければならない。優れた試験デザインには、溶媒を含まない陰性（試験液）コントロールも含まれるべきであるが、脊椎動物を試験する際には、さらに動物を使用することの倫理性も考慮しなければならない。エンドポイントの毒性値を算出するために治療群と比較する基準としては、陰性対照よりも溶媒対照の方が治療群との類似性が高いため、溶媒対照が望ましい。あるいは、溶媒対照と陰性対照の間に明らかに統計的に有意な差がない場合は、統計的検出力を高めるために両方の対照を組み合わせることができる [30]。しかし、これは米国EPAの覚書[31]と矛盾しており、エンドポイントの毒性値を算出するために治療群との比較の基準として陰性対照を用いることを要求しており、溶媒と陰性対照の間に有意差がある場合には試験を却下していることに留意すべきである。さらに，陰性対照と溶媒対照の間に有意差がある場合は，1つまたは2つのエンドポイントのみの試験よりも，複数のエンドポイントを有する試験の方が，タイプIIエラーの可能性が高いと考えられる。さらに、溶媒対照のみでは、溶媒と被験物質の間の潜在的な相乗的または拮抗的な相互作用を区別することができないため、そのような試験では真の毒性を過大評価または過小評価する可能性がある[32]。いずれにしても、試験溶液に溶媒を配合しないことが、これらの問題を回避する最善の方法である。
分散剤
界面活性剤や乳化剤などの分散剤の使用は避けるべきである（例えば、Tween 80、Cremophor RH-40、メチルセルロース0.01％、HCO-40など、OECDガイドラインの一部では推奨されているが[33-37]、他のガイドラインでは分散剤の一般的な使用が認められている[27-29,38]）。分散剤は、たとえ無害であっても、試験媒体中の被験物質の物理的形態に大きな影響を与える可能性がある。分散剤は、有機物質と相互作用して、低濃度で見かけの水溶解度を増加させることがある。それにより、被験物質のバイオアベイラビリティ、ひいては被験物質の見かけの毒性に直接または間接的に影響を与える可能性がある。また、水性媒体の表面張力を低下させる。例えば、臨界ミセル濃度以下の界面活性剤濃度では、フェナントレンとピレンの見かけの溶解度が純水の溶解度よりも3倍に増加した[39]。このように、分散剤を含む試験の結果は、定義された物質／分散剤システムに固有のものであり、被験物質の固有の毒性を代表していない可能性があり、他の暴露シナリオや条件に外挿することは困難である[3]。これは、農薬製剤のように分散剤を主成分として含む混合物の試験には適用されない。しかし、農薬の場合、有効成分の毒性は通常知られており、調合された製品の毒性と比較することができる。
テストが困難な二次的特性
水溶性の低い物質は、水生試験での管理をさらに困難にする二次的な特性（吸着性、揮発性、加水分解性の不安定さ、光分解性、液体など）を持つ場合がある。これらのケースでは、そのような物質を適切に試験するために、標準的な試験デザインに追加の修正を加える必要がある。これらの特性や潜在的な緩和策を完全に議論することは本研究の範囲外であるが、吸着に関するいくつかの問題を以下に議論する。低濃度では、わずかな吸着でも、分析で測定した溶存物質の濃度に劇的な変化をもたらすことがある。吸着は、試験容器の表面が、溶媒の使用や微生物の増殖基質となる物質の使用により、微生物の膜でコーティングされた場合に悪化することがある。試験容器に吸着した化学物質は、通常、試験生物には利用できないが、食物粒子に吸着した化学物質は、遠洋魚類や無脊椎動物には利用できる。また、化学物質が堆積物に吸着した場合、堆積物に生息する生物、底生魚、あるいはバクテリアが利用できる可能性がある。多くの場合、吸着は、曝露前に試験容器を試験溶液で平衡化すること（すなわち、コンディショニング）および／またはフロースルーシステムを使用することで低減することができる[2]。吸着が非常に強い場合には，関連する底生生物のいる水-底質系での試験や，調合された製品の使用（農薬の場合）が必要となる。藻類の試験では、細胞数の増加に伴い、吸着のための表面積が増加する。藻類はフ ロースルー試験に適していないが、藻類のバイオマスに吸着した物質は生物学的利用能 力があると考えられ、暴露濃度分析の一部として考慮されるべきである[40]。吸着損失の関連性は生物学的曝露との関連で考慮されなければならず、生物学的なネガティブ コントロール（生物のいない試験再現物）の分析はこの点で有用である。水に溶けにくく、二次的に試験が困難な特性を持つ物質の試験方法は、ケースバイケースで決定すべきであり、場合によってはそれらの特性の予備試験を利用し、該当する場合には適切な規制当局と合意の上で決定すべきである[1-4]。
実用的な試験方法
水に溶けにくい物質の毒性を確立するための実用的なアプローチは、動物福祉や物流・財務上の制約を考慮しつつ、確定的な試験の前にいくつかの予備試験を行うことである。広く分散した濃度での予備的な毒性試験（または範囲確認試験）は、未溶解物質を含む可能性のある飽和溶液の1回の処理を含むべきである。溶解濃度が測定できない場合には、未溶解物質を含む処理を行うことで、曝露期間中に飽和状態が維持されたという経験的な証拠が得られるが、毒性が観察された場合には物理的な影響が原因である可能性がある。試験媒体への溶解性を予測するためのデータが不十分であるが、溶解濃度を測定するための適切な分析方法がある場合、予備的な毒性試験を、分析測定の前に分離工程（例えば、遠心分離やろ過）を含む予備的な溶解性試験と任意に組み合わせて、試験条件下での最大溶解濃度（飽和限界）を概算することができる。
その後、予備試験で毒性が認められなければ、飽和溶液を用いた「限界試験」として確定試験を行い、測定された溶存画分に基づいて試験結果を出す。溶解濃度が測定できない場合は、溶解していない物質の存在下で試験を行い、飽和限界では影響がないとの結果を記載し、その飽和限界を計算および／または観察による最良の方法で推定する。
予備試験で毒性が観察された場合は、適切な濃度で確定試験を行うが、（潜在的な物理的影 響を除外するために）過剰な物質を除去し、試験結果は測定された溶存率に基づいて行う。溶存濃度が測定できない場合は、飽和したストックからの希釈系列を試験し、試験結果を飽和溶液のパーセンテージとして記載し、利用可能な最善の方法で飽和限界を推定する。
リスクアセスメントの考慮事項
溶解度限界までの短期毒性試験は、リスクアセスメントで十分に考慮されるべきである。報告されている試験終点値が溶解度限界を超えており、有害作用が観察されない場合（例：LC50 または NOEC > 飽和限界）、再試験は必要ないが、試験条件下での終点値は溶解度限界（飽和限界）を超えていると見なすべきである。飽和限界において有害な急性作用が見られなかった場合（すなわち NOEC が飽和限界と同等かそれ以上である場合）は、通常、さらなる急性試験や有害急性分類は必要ないはずである。殺虫剤については、製剤データが入手可能であれば、それを証拠の重み付けの一部として使用することができる。さらに、このような化合物の慢性試験が必要とされるのは、長期暴露の可能性がある場合（例 えば、植物保護製品を複数回使用する場合や、水中での DT50 が 2 日以上の場合）、生物蓄積の可能性がある場合 （logPow > 3 で示される）、あるいは飽和限界では毒性を示さない物質のリスクが許容可能であることを 実証する場合に限られるべきである。後者の場合、飽和限界でのみ慢性試験（「限界」試験）を行うことは、許容できる設計であり、動物福祉の観点からも正当化されるべきである。物質が飽和限界において急性毒性影響を及ぼさないと予測される場合は、規制機関に相談することをお勧めする。規制機関は、そのまま慢性毒性試験に進むことを好むかもしれないからである。3 つの標準的な栄養段階（魚類、無脊椎動物、藻類）での試験で飽和限界（または現場での 現実的な水溶性限界）での影響がない場合は、安心のためにさらに多くの分類群（できれば非脊椎動物） での試験を提案し、水溶性限界でのリスクがないことを意味する毒性曝露比（TER）が許容範囲 （TER¼1）となるように評価係数を 1 に下げることができる。
将来的に検討する価値のある新しい評価方法は，関連する物質群に対する一般的な無懸念暴露閾値（ETNC）である[14]．リスク評価は，無懸念水生生物曝露閾値（ETNCaq）の値と，水に溶けにくい（すなわち，最大でも飽和限界まで）物質の水生生物曝露レベルを比較することで行うことができる．したがって，水溶解度がETNCaq以下の物質の水生暴露量は生態毒性学的無影響濃度を超えることはなく，そのリスクは無視できると評価することができる。
結論
溶解性の低い物質を用いた試験では、長年にわたり様々な方法で溶媒が使用されてきており、溶解しない（余剰の）物質も様々な方法で処理されてきた。その結果、エンドポイントの毒性値が変化し、誤った値になる可能性がある。規制対象の水生生態毒性試験における難溶性物質の取り扱いに関するガイダンスがある が、個々の試験ガイドラインでは矛盾していることがある。したがって、これらの試験ガイドラインでは、一般的なガイダンス文書、できれば OECD ガイダンス文書の最新版を参照する必要がある[2]。さらに、これらの試験で得られたエンドポイント毒性値をリスク評価に使用することには問題がある。したがって，水に溶けにくい成分の試験と適切なエンドポイントの選択の両方をカバーする，明確で世界的に認められたガイダンス文書があれば，植物防護製品の水生試験戦略とリスクアセスメントが改善され，試験動物の数を減らすことができる。本研究では，利用可能な法規制や指針，経験に基づいた提案を行い，一貫した指針の策定に向けた情報を提供している。しかし，いくつかの特性が重なって試験が困難な物質は常に存在するため，ケースバイケースのアプローチが必要である。