Caco-2細胞におけるグリアジンペプチドが引き起こすミトコンドリア代償反応に関する試験管内試験研究

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小麦(グルテン)・乳製品

An In Vitro Study on Mitochondrial Compensatory Response Induced by Gliadin Peptides in Caco-2 Cells

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6514596/

要旨

食餌性グリアジンの毒性は多岐にわたる。腸管上皮では、ミトコンドリアとグリアジンによる酸化ストレスとの相互作用については十分に検討されていない。本研究では、Caco-2細胞をペプシントリプシンで消化したグリアジンに単独または抗酸化剤である2,6-ジ-t-ブチル-p-クレゾール(BHT)と組み合わせて24時間曝露し、ミトコンドリアの生合成とmtDNAへの影響を調べた。培養液中で24時間および48時間培養した後、細胞のストレスからの回復能力を測定した。グリアジンで誘発された酸化ストレスは、代償反応を誘発した。PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1alpha)PrxIII(Peroxiredoxin III)タンパク質、およびmtDNA量の急激かつ有意な増加が引き起こされた。mtDNAの完全性に対するグリアジンの影響については、3つのmtDNA領域において、鎖切断、脱落部位、修飾塩基を分析した。D-ループはOri-LやND1/ND2よりも壊れやすいターゲットであることがわかった。D-loopの損傷の時間的傾向は、mtDNAの量の傾向と平行していた。全体として、グリアジン暴露後48時間でコントロール値に向かう傾向が見られた。最後に、BHTはグリアジンの影響を打ち消すことができた。本研究の結果は、グリアジンによる酸化ストレスがミトコンドリアに及ぼす影響を浮き彫りにし、グルテン関連疾患の病態生理に関する知識を向上させる貴重な証拠となった。

キーワード

Caco-2細胞、グリアジン、グルテン関連疾患、ミトコンドリアバイオジェネシス、mtDNA、mtDNA損傷、酸化ストレス、PGC-1α、PrxIII

1. はじめに
小麦のグリアジンに含まれるグルテンと呼ばれるタンパク質の複合体は、大麦やライ麦の相同

タンパク質とともに、「グルテン関連障害」と定義される一群のヒト疾患(すなわち、自己免疫性セリアック病(CD)小麦アレルギー、非セリアックグルテン過敏症(NCGS))の原因となっている。[1]. CDは,遺伝的にこれらのタンパク質を摂取すると発症する。CDは,グリアジンの断片が腸上皮を通過し,抗原提示細胞によって腸粘膜に存在するHLA DQ2/DQ8 Tリンパ球に提示されることによって引き起こされる,小腸の炎症性疾患である[2]。免疫毒性のあるグリアジンペプチドは、適応免疫反応と自然免疫反応の両方を引き起こし、最終的にバリアーの崩壊 [3]や粘膜の損傷 [4]につながる。実際、グリアジンは、酸化ストレスの誘導を含む広範な毒性スペクトルを示している[5]。炎症反応は,活性化した白血球による「呼吸バースト」にも依存しており,これによって大量の活性酸素種(ROS)が放出される[6]。活性酸素は、消化管(GI)に豊富に存在し、多くのGI粘膜の病態は、「爛れた活性酸素の生成」と関連している[7,8]。CDに関しては、グリアジンは、宿主の消炎能力をはるかに超えて、腸管粘膜のプロオキシダント・アンチオキシダントのバランスに影響を与えている可能性がある[9,10]。活性酸素の主要な細胞量のアルファとオメガであるミトコンドリアは、酸化ストレスに重要な役割を果たしている[11]。ミトコンドリアの異常は、いくつかの腸の炎症性疾患で実証されており、ミトコンドリアを標的とした抗酸化治療戦略が提案されている[12,13,14]。グルテンの毒性とミトコンドリア,活性酸素,炎症とを結びつける分子メカニズムは,ミトコンドリアの活性酸素が多タンパク質のカスパーゼ-1活性化複合体(NLRP3インフラマソーム)を活性化する能力に依存している可能性がある[15,16]。

最近、CD患者のリンパ球におけるミトコンドリアDNA(mtDNA)の含有量が健常者と比較して増加していることが明らかになったが、これは、CD患者の細胞が病気に伴う酸化ストレスによって損なわれた場合の代償反応として、ミトコンドリアの生合成が誘導されていることを示唆している[12]。ミトコンドリアと、炎症反応に関連するグリアジン誘発性酸化ストレスとの相互作用については、腸管上皮では十分に検討されていない。CDにおける酸化的不均衡とミトコンドリア機能障害を伴うグリアジン毒性を調べるために、我々は、この疾患を試験管内試験で研究するのに十分適切なツールとして、ヒト腸管上皮Caco-2細胞株を用いて、動態研究を行った[18]。細胞は,ペプシントリプシン消化グリアジン(PTG)を単独または合成フェノール化合物であるブチル化ヒドロキシトルエン(2,6-ジ-ブチル-p-クレゾール(BHT))と併用して曝露した。ブチル化ヒドロキシトルエンは,活性酸素消去剤として抗酸化作用を発揮する[19]。特に,24時間処理した後のミトコンドリア生合成の誘導の可能性とmtDNAへの遺伝毒性の影響を調べた。さらに,培養液中でさらに24時間および48時間培養した後に測定を繰り返し,グリアジン誘導ストレスから細胞が回復する能力を評価した。

2. 結果

2.1. MTT試験

処理した細胞と未処理の対照細胞の細胞生存率を、ミトコンドリアの脱水素酵素の活性に依存するMTT試験(図1)で評価した。PTGを24時間作用させた後に採取した細胞では、脱水素酵素の活性が低下し、未処理の対照細胞と比較して生存率が有意(p < 0.01)に低下した(-14.1 %)。BHTをPTGと併用した場合、活性酸素消去剤は細胞生存率を部分的にしか改善できず、対照細胞と比較して9.0%の有意な減少(p<0.05)が見られた(A群)。この生存率の低下は、最初の処理を行い、培養液中で24時間培養した後に採取した細胞においても顕著で、PTG細胞では24.4%、PTG+BHT細胞では23.2%の有意な低下が見られた(p<0.0001)。最後に、PTGで処理した後にBHTで24時間培養した細胞でも、細胞生存率が21.0%に相当する有意な減少が見られた(B群)。最初の処理から48時間後に採取した細胞では、処理細胞と対照細胞の間に有意な差は見られなかった(C群)。

図1 MTT試験によるCaco-2細胞の細胞生存率

Ctrl:無処理のコントロール細胞、PTG:PTG(1 mg/mL)と24時間インキュベートした細胞、PTG+BHT:PTG(1 mg/mL)とBHT(50 µM)と24時間共にインキュベートした細胞、BHT:PTG(1 mg/mL)と24時間インキュベートした後、洗浄し、BHT(50 µM)と24時間インキュベートした細胞。 グループA:24時間の処理終了時に収穫した細胞。B群:24時間処理後に洗浄し、さらに培養液で24時間培養した細胞。C群:24時間処理後に洗浄し、さらに培養液で48時間培養した後に収穫した細胞。棒グラフは、独立した3回の実験の平均値とSEM値を示す。統計的な差は、Dunnett’s post-testを用いたOne-way ANOVAにより決定した。*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.0001. Dunnett’s post-test vs. Ctrl.

2.2. ミトコンドリア・バイオジェネシス

ミトコンドリアの生合成に及ぼす影響を、ミトコンドリア生合成のマスターレギュレーターである転写コアクチベーターPeroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α(PGC-1α)タンパク質の相対量と、処理細胞と未処理対照細胞の相対的なmtDNA含量を測定することで評価した。

PGC-1αの相対量は、A群の処理細胞と未処理対照細胞との間で統計的に有意な差が認められ、PTG細胞では対照細胞に比べて31%の増加が認められた(p<0.05)。PTGと合成抗酸化剤であるBHTを共存させた場合、PGC-1αは63%減少した(p<0.0001)。さらに培養液中で24時間培養したところ(B群)処理した細胞と未処理の細胞の間には統計的に有意な差が見られたが(P:0.0394,一元配置分散分析)対照と比較してどの実験条件もポストテストでは統計的有意差に達しなかった。最後に、C群の細胞間には有意な差は認められなかった(図2,パネルA)。

図2 PCG-1αとmtDNAの相対的な含有量

Ctrl:無処理のコントロール細胞、PTG:PTG(1 mg/mL)と24時間インキュベートした細胞、PTG+BHT:PTG(1 mg/mL)とBHT(50 µM)と24時間共にインキュベートした細胞、BHT:PTG(1 mg/mL)と24時間インキュベートした後、洗浄し、BHT(50 µM)と24時間インキュベートした細胞。 グループA:24時間処理の最後に収穫した細胞。B群:24時間処理後に洗浄し、さらに培養液で24時間培養した細胞。C群:24時間処理後に洗浄し、さらに培養液で48時間培養した後に収穫した細胞。棒グラフは、少なくとも3回の独立した実験を二重に行った場合(パネルA)または5回の独立した実験を三重に行った場合(パネルB)の平均値とSEM値を示す。パネルAには代表的なウエスタンブロットを示した。統計的差異は一元配置分散分析(Dunnett’s post-test)により決定した。*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.0001 Dunnett’s post-test vs. Ctrl.

mtDNA相対量に関しては、グループAの細胞では、処理した対照細胞と未処理の対照細胞でmtDNA量が有意に異なっていた。PTGの曝露により、mtDNA含量は未処理細胞に対して60%増加し、Dunnettのpost-testで統計的に有意であった(p < 0.0001)。活性酸素消去剤であるBHTは、この増加を抑制した。PTGとBHTを同時に曝露した細胞では、mtDNA量が11%減少した(p<0.05)。最初の曝露から 24時間後に採取した細胞(B群)では、mtDNAレベルは、異なる処理を施した細胞と対照群の間で依然として有意に異なっていた。PTG細胞では、対照細胞に比べてmtDNAがかなり(72%)増加しているように見えた(p < 0.0001)。PTG+BHT細胞のmtDNA含量は、対照細胞と比較して28%と有意に減少した(p < 0.0001)。興味深いことに、PTGへの曝露から 24時間後に活性酸素消去剤を投与した場合(BHT細胞)mtDNA含量の減少は17%にとどまった(p<0.0001)。注目すべきは、最初の暴露から48時間後に細胞を採取した場合(Cグループ)対照の未処理細胞と比較してmtDNA含量に有意な差は見られなかったことである(図2,パネルB)。

2.3. ミトコンドリアの抗酸化反応

PTGへの曝露が細胞の抗酸化防御を活性化することができるかどうかを評価するために、ミトコンドリアの活性酸素消去タンパク質であるペルオキシレドキシン3(PrxIII)の量を測定した。PTGを24時間処理したCaco-2細胞は、対照細胞に比べてミトコンドリア酵素の量が2.5倍に増加したことから、統計学的に有意な代償的抗酸化メカニズムを形成することが示された(p < 0.0001)。PTGとBHTを併用した細胞では、PrxIIIが37.0%減少した(A群)。B群およびC群では、処理した細胞と未処理のコントロール細胞との間に有意な差は認められなかった(図3)。

図3 ペルオキシレドキシン3(PrxIII)の相対量

Ctrl:無処理のコントロール細胞、PTG:PTG(1 mg/mL)と24時間インキュベートした細胞、PTG+BHT:PTG(1 mg/mL)とBHT(50 µM)と24時間共にインキュベートした細胞、BHT:PTG(1 mg/mL)と24時間インキュベートした後、洗浄し、BHT(50 µM)と24時間インキュベートした細胞。 グループA:24時間の処理終了時に収穫した細胞。B群:24時間処理後に洗浄し、さらに培養液で24時間培養した細胞。C群:24時間処理後に洗浄し、さらに培養液で48時間培養した後に収穫した細胞。棒グラフは、少なくとも3回の独立した実験を二重に行った場合の平均値とSEM値を示す。代表的なウェスタンブロットを示す。統計的差異は、一元配置分散分析(Dunnett’s post-test付き)により決定した。***: p < 0.0001 Dunnett’s post-test vs. Ctrl.

2.4. MtDNA損傷

グリアジンによるmtDNAへの遺伝毒性作用の調査と、可能性のあるホットスポット領域の検索は、半長鎖のqPCR法で行った。mtDNA分子に沿った2つの制御領域(D-ループとOri-L)と1つのコード領域(ND1/ND2)を分析した。D-loop領域を含む長いアンプリコンを増幅したところ、A群に属する処理細胞と未処理の対照細胞のCtの値には、統計的に有意な差が見られた。PTGで処理した細胞のCtは、未処理の対照細胞のCtよりも3.5サイクル高かった(p < 0.0001)。この差は、2ΔCtの式によれば、PTG処理細胞は対照細胞に比べて11倍のダメージを受けたことになる。活性酸素消去剤の効果については、BHTと共培養した細胞は、未処理の対照細胞と比較して、閾値Ctサイクルの有意な減少を示し(p < 0.0001)その結果、ΔCtは負の数(-1.8)となり、未処理の細胞と比較して0.3倍低いダメージに対応した。B群の細胞を考慮すると、Ct値の差は顕著であった。PTG細胞のCt値は、対応する未処理のコントロール細胞のCt値よりも4.0サイクル高かった(16倍のダメージ)(p < 0.0001)。PTG+BHT細胞のΔCtは-0.9(p < 0.0001)であり、対照細胞に比べて0.5倍のダメージがあることを示した。PTG後にBHTに暴露した細胞を対照細胞と比較して検討した場合、ΔCtに有意な差は見られなかった。処理後48時間後に採取した細胞のCt値は、やはり有意差があった(C群)。PTGと対照細胞の間では、3点-1 ΔCt(8倍の損傷を表す)が認められた(p < 0.0001)のに対し、PTG+BHT細胞と対照細胞の間では、-0.9 ΔCt(0.5倍の損傷)が認められた(p < 0.0001)。最後に、PTG後にBHTに曝露した細胞と対照の細胞のCt値には、有意な差は見られなかった(図4,パネルA)。

図4 mtDNA損傷の検出

Ctrl:無処理のコントロール細胞、PTG:PTG(1 mg/mL)と24時間インキュベートした細胞、PTG+BHT:PTG(1 mg/mL)とBHT(50 µM)と24時間共にインキュベートした細胞、BHT:PTG(1 mg/mL)と24時間インキュベートした後、洗浄し、BHT(50 µM)と24時間インキュベートした細胞。 グループA:24時間処理の最後に収穫した細胞。B群:24時間処理後に洗浄し、さらに培養液で24時間培養した細胞。C群:24時間処理後に洗浄し、さらに培養液で48時間培養した後に収穫した細胞。棒グラフは、3連で行った5回の独立した実験の平均値とSEM値を示す。統計的な差異は、Dunnett’s post-testを用いたOne-way ANOVAにより決定した。*: p < 0.05; ***: p < 0.0001 Dunnett’s post-test vs. Ctrl.


Ori-L領域のロングアンプリコンのCtについては、24時間培養終了時に採取した処理細胞と未処理のコントロール細胞との間のΔCtが統計的に有意であった(A群)。Dunnett’s post-testにより、コントロール細胞とPTG(2.4 ΔCt)およびPTG+BHT(-1.0 ΔCt)の両細胞間のΔCtの有意性(p < 0.0001)が明らかになった。これらのCt値の変化は、対照と比較して、PTG細胞では5.3倍、PTG+BHT細胞では0.5倍のダメージの増加に相当する。最初の処理から 24時間後に採取した細胞と、PTGの後にBHTで処理した細胞を考慮した場合(B群)Ct値の差は顕著であった。PTG細胞では、コントロールに比べて統計的に有意な+2.0のCt値の増加(4倍のダメージに相当)を示し(p < 0.0001)PTG+BHT細胞では、統計的に有意な-1.0のΔCt(2倍のダメージの減少)を示した(p < 0.0001)が、BHT細胞とコントロールの間の差は統計的に有意ではなかった。グループCの細胞を見ると、Ctの値は有意に異なっていた。ポストテストにおいて、PTG細胞とコントロール細胞の間のΔCtは、有意に増加することが示された(p < 0.0001)(1.8 ΔCt、約4倍のダメージ増加に相当)。それ以外では、PTG+BHTと対照細胞との間のΔCtは、有意に(p < 0.05)減少した(-0.4ΔCt,0.8倍のダメージ減少に相当)。BHTと対照細胞との間のΔCtは、有意にはならなかった(図4,パネルB)。

ND1/ND2領域の解析では、A群、B群ともに、処理した細胞と未処理の対照細胞との間のCtの差は統計的に有意であった。PTGと対照細胞の間のΔCtは、前者では+2.3,後者では+2.0であった。これらのΔCtsは統計的に有意であり(p < 0.0001)損傷が4倍になったことに相当する。PTG+BHT細胞については、コントロール細胞と比較したCt値の差は、A群、B群ともに-1.6(0.3倍のダメージ減少)であった(p < 0.0001)。BHTと対照細胞との差は、B群に属する細胞では統計的に有意ではなかった。C群に属する細胞では、異なる処理に関するものとして、Ct値の統計的に有意な差が見られた(p:0.03228,One-way ANOVA)。ポストテストを行ったところ、処理した細胞とコントロールの細胞の間には有意な差は見られなかった(図4,パネルC)。

3つの分析領域に関連する短いアンプリコンは、比較したサンプル間で1Ct以上の差はなかった。

2.5. アポトーシス

PTG処理がアポトーシス促進効果を発揮するかどうかを検証し、その時間経過を評価するために、異なる実験条件で処理したCaco-2細胞におけるアポトーシス細胞の割合を評価した。図5に示すように、PTGを24時間投与した場合、コントロールと比較して、アポトーシス細胞の割合が3.7%と有意に増加した(p < 0.0001)。PTGとBHTを24時間共に投与した場合、アポトーシス細胞の割合も有意に(p < 0.0001)増加した(3.6%)(A群)。PTG細胞では、アポトーシス細胞が全体の13.5%を占め、未処理の対照細胞のアポトーシス細胞の割合と比較して有意に異なっていた(p < 0.0001)。PTG+BHTおよびBHT細胞でも、アポトーシス細胞の割合は、未処理の細胞で観察された割合(いずれの実験条件でも11.9%)と比較して、有意に高かった(p < 0.0001)。最後に、グループCの細胞では、処理したものと未処理のコントロールのものとでは、アポトーシス細胞の割合に有意な差は見られなかった(図5)。

図5 Caco-2細胞のアポトーシス反応

Ctrl:無処理のコントロール細胞、PTG:PTG(1 mg/mL)と24時間インキュベートした細胞、PTG+BHT:PTG(1 mg/mL)とBHT(50 µM)と24時間共にインキュベートした細胞、BHT:PTG(1 mg/mL)と24時間インキュベートした後、洗浄し、BHT(50 µM)と24時間インキュベートした細胞。 グループA:24時間の処理終了時に収穫した細胞。B群:24時間処理後に洗浄し、さらに培養液で24時間培養した細胞。C群:24時間処理後に洗浄し、さらに培養液で48時間培養した後に収穫した細胞。棒グラフは、独立した3回の実験の平均値とSEM値を示す。統計的な差は、Dunnettのポストテストを用いたOne-way ANOVAによって決定した。

3. 考察

酸化ストレスは、慢性炎症性自己免疫性CD [5,9,10,12,21]を含む多くのGI疾患 [20]において役割を果たしている。食餌性グリアジン[9]とは別に、試験管内試験の研究では、1 mg/mLの濃度のPTGが酸化的不均衡を引き起こす能力を評価している[10,22]。他のいくつかの著者[23,24,25]は,すでに1 mg/mLのPTGを使用し,この濃度が生物学的効果を明らかにするのに効果的であることを証明しており,我々のグループも以前の研究で1 mg/mLのPTGを使用し,このタンパク質によって引き起こされる細胞間伝染性の変化に対するLactobacillus rhamnosus GGの保護的役割を評価した[3]。

ミトコンドリアは,呼吸鎖を介して活性酸素を発生させるだけでなく,細胞内の主要な活性酸素の標的でもあるため,グリアジンペプチドによって引き起こされるミトコンドリアの影響を調べた。この速度論的研究では,Caco-2細胞をPTG単独または抗酸化剤であるBHT[19]と組み合わせて24時間曝露した。曝露直後と,さらに24時間または48時間培養した後に細胞の反応を評価し,PTGによるストレスからの回復能力を評価した。さらに、活性酸素と合成抗酸化物質の複雑な関係をよりよく調べるために、PTGで誘導した後にBHTを曝露した細胞でも細胞応答を評価した[26]。

PTGへの曝露は、ミトコンドリアの代謝に影響を与えることができた。これは、今回報告されたPTGにおけるミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性の減少が、対照細胞と比較して示されている。このような活性の低下は、細胞の生存率に影響を与え、他の研究者によってすでに報告されているように、軽度の細胞毒性効果をもたらした[10]。我々がMTTアッセイで決定した細胞毒性の実体は、GiovanniniらがPTG処理Caco-2細胞で報告した細胞計数による評価よりも小さいようである[27]。この不一致は、生存細胞の過大評価によるものと考えられる。この発見は、本論文で明らかにされたように、PTGによって誘導されたミトコンドリアの生合成によって引き起こされた、細胞あたりの脱水素酵素活性の増加によるものかもしれない。しかし、この細胞毒性は、誘導された酸化ストレスだけに依存しているわけではないようで、BHTの細胞毒性を打ち消す能力が限られていることが示された。これらの知見は、グリアジン誘発性腸症が複数の病理学的メカニズムに依存していることを裏付けるものである[1]。PTG暴露後48時間後に採取した処理細胞と未処理細胞の間で細胞生存率に有意な差がなかったことは、これらの細胞がPTGによる軽度の細胞毒性から回復する能力を持っていることを示している。

MTT法でPTGによるミトコンドリアの機能低下が確認されたことから、我々はこの実験モデルにおけるミトコンドリアの生合成について調べた。ミトコンドリアの生合成は,ミトコンドリアと核の両方のゲノムにコードされるタンパク質が関与する複雑なプロセスであり,PGC-1αは核-ミトコンドリアクロストークのマスターレギュレーターである[28]。活性酸素や反応性窒素種(RNS)などの反応性分子種は,刻々と変化する細胞環境に適応するために,転写因子を制御できるシグナルとして認識されるようになっている [29,30]。PTGに暴露した細胞では、PGC-1αの量が対照細胞に比べて有意に増加したことから、ミトコンドリアの生合成が誘導されたことが示され、ストレス要因であるグリアジンによる活性酸素の増加というシナリオによく合致している[10,22]。さらに、PTGと活性酸素消去剤であるBHTを共存させた細胞では、PGC-1αの量が大幅に減少したことから、細胞の酸化状態のバランスを微調整することの重要性が指摘された。抗酸化物質は、酸化ストレスの原因となる活性種の除去に関与する分子である。しかし,細胞内プロセスにおけるシグナル伝達分子としての活性酸素の役割を考慮すると[31],外因性の抗酸化物質を補充して酸化還元状態を乱すことは,有害な影響を及ぼす可能性がある。共曝した細胞では,抗酸化物質であるBHTが,誘導された活性酸素だけでなく,細胞の生理機能に関与する内因性の活性酸素も消去したと考えることができる[31]。PGC-1αの発現の時間経過に関しては、Caco-2細胞は、PTGおよびPTG+BHTの両方の相反する効果からすぐに回復することが示された。

酸化ストレスは、その重症度に応じて、ミトコンドリアの生合成に異なる作用を及ぼす可能性がある。これは、mtDNA含量に関する他の研究でも実証されている。特に、様々な種類のストレス因子による軽度の酸化ストレスは、様々な組織や細胞株においてmtDNA含量の増加を引き起こすことが報告されている。その逆に、重度の酸化ストレスを受けると、mtDNAが失われてしまう[32,33,34]。これらの報告は,ミトホルミシス理論によって最初に提唱され,後に一貫して実証された,ミトコンドリア生合成の制御因子としての酸化ストレス刺激の二相性を支持している[35]。

PTGを投与した細胞では、未投与の細胞に比べてmtDNA量が大幅に増加したという分子設定がなされた。このような増加は曝露から 24時間後に頂点に達し、mtDNA量はさらに24時間後に対照値に戻った。活性酸素消去剤がこの増加を抑制する能力を持っていることから、PTGによって誘発された酸化ストレスが引き金になったことが証明された。特にグループCの細胞では、PTGとコントロールの間に有意な差がなかったことから、細胞の抗酸化防御システムがレドックスバランスの回復に有効であることを示していると考えられる。注目すべきは、mtDNA含量の増加は、環境汚染物質への曝露[37]、加齢[38]、糖尿病性網膜症[39]、CD[12]など、軽度の酸化ストレスを伴ういくつかの疾患の臨床現場ですでに報告されていることである。

本研究の独創性は,PGC-1αタンパク質の発現とmtDNA量を同時に評価することで,ミトコンドリア生合成の経路に沿った異なるステップの時間的な比較を可能にしたことにもある.PTGによる軽度の酸化ストレスは、最初の暴露後にすでにPGC-1αとmtDNAの両方の含有量を増加させた。しかし、24時間後にはPGC-1α含量の増加は見られなくなったが、mtDNA含量はさらに増加した。この変化は、ミトコンドリア生合成のマスターレギュレーターの誘導に始まり、mtDNAの複製という最終ステップに至るまでの経路に沿った事象の時間的連続性を示している。この仮説をさらに裏付けるのが、PTG+BHT細胞で得られたデータである。実際、共同処理した細胞では、処理直後にPGC-1αとmtDNAの同時減少が観察された。この減少は24時間後にはPGC-1αでは消失し、mtDNAでは長く続いた。

過剰な活性酸素を除去するために、細胞は抗酸化物質と抗酸化酵素を備えている。主な抗酸化酵素は,ほとんどの活性酸素が生成される細胞内コンパートメントであるミトコンドリアに存在するものである[40]。抗酸化機能を持つミトコンドリアのタンパク質であるPrxIIIは,PGC-1αによってトランザクティヴ化される抗酸化物質の一つである[41]。実際,PTGに暴露した細胞では,この酵素の量が有意に増加し,PGC-1αの増加と平行していた。細胞の抗酸化反応は時間的に限定されており、B群の細胞ではすぐにコントロール値に戻ったことが明らかになった。

他の著者は、コメットアッセイを用いて、Caco-2細胞の全DNAに対するグリアジンペプチドの遺伝毒性効果を既に示している[22]。本研究では,mtDNAが酸化的病変に対して特に脆弱であり,その結果,ミトコンドリアの機能不全を引き起こすことが知られていることから,mtDNAの損傷について調べた[42].酸化ストレスによって誘発されるmtDNAの損傷には,一本鎖および二本鎖の切断,脱落部位,酸化されたDNA塩基などがあり,中でもグアニンは最も酸化されやすい[43].酸化ストレスはmtDNA分子に沿って一様な損傷を引き起こさないことが明らかになっているため[44,45],我々はPTGによる損傷がこの特徴に合致するかどうかについても調べた。ここで示されたデータによると、PTGはmtDNAに対して遺伝毒性を示し、その遺伝毒性はPTGによって誘発された酸化ストレスに依存しているようであったが、ROSクエンチャーであるBHTはそれを打ち消すことができた。

MtDNAの損傷は、分析した3つの領域(Dループ、Ori-L、ND1/ND2領域)すべてに関わる早発の事象として現れたが、Dループは損傷の程度とその持続性の両方に関して、より脆弱な標的であると考えられた。この領域は、亜致死量の過酸化水素に曝されたヒト初代皮膚細胞におけるmtDNA損傷を評価するために同じ方法を用いた他の著者が報告したものと同等のΔCt値を示した[46]。グループAの細胞では、PTG由来のロングアンプリコンとコントロール細胞との間のΔCtは、Ori-LおよびND1/ND2の両領域よりもD-ループで高かった。この特徴は、ポリメラーゼの進行を止めたり遅らせたりすることができる酸化的な病変の存在が高いことを示している[47,48]。最初の暴露から 24時間後と48時間後には、PTGと対照細胞のΔCtは、Ori-L領域とND1/ND2領域の両方で漸減する傾向を示した。これは、その間に修復された酸化的病変の一過性の特徴を示すものである。

一方、D-loop領域では、PTGとのインキュベーション終了から 24時間後に採取した細胞のΔCtは、処理終了時に採取した細胞のΔCtに比べてさらに増加していた。PTG処理後48時間後に採取した細胞でのみ、ΔCtは減少する傾向を示した。注目すべきは、D-loopにおけるΔCtの変化の時間的傾向は、mtDNAの相対量の変化と平行していたことである。文献によると、Dループにおける「制御された酸化的損傷と修復」は、軽度の酸化的ストレスにさらされた後に観察されたミトコンドリア生合成の促進を説明することができる[45]。なぜなら、酸化された塩基の存在は、mtDNAの転写と複製の開始に深く関与するミトコンドリア転写因子A(TFAM)[49]に対するDNAの親和性を高めるからである[50]。

最後に、本研究の結果は、グリアジンがCaco-2細胞にプロアポトーシスプロセスを誘発したことを確認し[22]、そこから救出する細胞能力を示している

我々の知る限り、本研究はPTGによる酸化ストレスがミトコンドリアに及ぼす影響を明らかにした初めての研究である。ミトコンドリアの反応は、軽度の酸化ストレスを特徴とする他の状況で誘発されるものと同様に、生合成の代償的な誘導で構成されていた[12,37,38,39]。この研究から得られた証拠は,ミトホルミシスの理論[35]をさらに裏付けるものであるが,この反応自体の基礎となる分子メカニズムを解明したわけではない。

4. 材料と方法

4.1. 細胞培養条件

ヒト大腸腺癌由来のCaco-2細胞株は、Interlab Cell Line Collection(IST, Genoa, Italy)から入手し、RPMI-1640,10%ウシ胎児血清(FBS)2mMグルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを用いて、37℃、5%CO2で単層培養した。すべての試薬はSigma Aldrich(ミラノ、イタリア)から入手した。

4.2. グリアジンダイジェスト

PTGは、Dragoら[51]の記述に従って新たに調製し、PBSに1 mg/mLの濃度でCaco-2細胞に添加した。

4.3. 細胞処理

本研究の実験計画は、最初にPTG単独(1 mg/mL)またはBHT(50 µM)との共投与で24時間CaCo-2細胞を曝露することからなる(それぞれ、PTGおよびPTG+BHT)。細胞は直ちに回収するか(A群)あるいは洗浄した後、さらに培養液で24時間(B群)または48時間(C群)培養してから回収した。PTG誘導酸化損傷に対するBHTによる修復効果を強調するために、実験のサブセットでは、PTGのみで24時間処理した細胞を洗浄し、BHT(50μM)と24時間インキュベートした後、直ちに収穫する(B群)か、洗浄してさらに培養液中で24時間インキュベートした(C群)(BHT)。各処理には、その対照(未処理の細胞)も含まれていた。

4.4. MTT試験

細胞生存率は、3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide MTT試験により評価した。このアッセイは,MTTテトラゾリウム塩の還元がミトコンドリアのデヒドロゲナーゼの活性によるものであるという仮定に基づいている[52]。培養液に24時間暴露した後、あるいは以下の培養期間が終了した時点で、MTTストック液(培地中5mg/mL)を元の培養量の10分の1の量で各ディッシュに加え、加湿したCO2中で37℃で2時間培養した。その後、培地を酸性のイソプロパノール(0.1N HCl absolute isopropanol)に交換した。フォルマザンの形成を570nmで分光光度測定した。

4.5. ウェスタンブロット

コントロールおよび処理細胞の各ペレットを、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)を添加したトータルライシスバッファー(Pierce Ripa buffer, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)で処理し、タンパク質抽出液を得た。

ホモジナイズし、14,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した後、標準的なブラッドフォードアッセイ(Bio-Rad, Milan, Italy)でタンパク質濃度を測定した。各サンプルから抽出した10 µgの全タンパク質のアリコートを5×Laemmliサンプルバッファーで変性させ、ウエスタンブロット分析のために4-12%プレキャストポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad, Milan, Italy)にロードした。一次抗体として,抗PGC-1α(NBP1 04676, Ab NOVUS, Centennial, CO, USA)(1:5000),抗PrxIII(LFPA0030, Ab FRONTIER, Seoul, Korea)(1:5000),および抗β-actin(A2066, Sigma Aldrich, Milan, Italy)(1:20,000)を用いた。一晩インキュベートした後,膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ二次抗体でさらにインキュベートした。蛋白質は化学発光(Clarity Western ECL substrate, Bio-Rad, Milan, Italy)で検出した。信号は,Chemi Doc SystemおよびImage Labソフトウェア(Bio-Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA,USA)を用いたレーザーデンシトメトリーによって分析した。そして、各バンドのデンシトメトリー値(OD単位)をβ-アクチンの発現量に対して正規化した。

4.6. mtDNAの含有量

mtDNAの相対的な含有量は、10 ngの全DNAを鋳型として、SYBR Greenケミストリーを用いた定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)により測定した。核DNA(β-アクチンプライマーセット)に対するmtDNA含有量(mtDNAプライマーセット)の定量化は、既報のとおりである[53]。プライマーの配列は表1を参照。

表1 オリゴヌクレオチドプライマーの配列
Primer Set Forward Primer Reverse Primer (nps) (nps)
mtDNA 5′ ACGCCATAAAACTCTTCACCAAAG 3′ 5′ GGGTTCATAGTAGAAGAGCGATGG 3′ 3,458–3,481 3,568–3,545
β-actin 5′ TTGGCAATGAGCGGTTCC 3′ 5′ AGCACTGTGTTGGCGTAC 3′ 124-141 271-254
ND1/2 long 5′ CCCTTCGCCCTATTCTTCAT 3′ 5′ GCGTAGCTGGGTTTGGTTTA 3′ 3,961-3,980 4,997-4978
ND1/2 short 5′ CCCTTCGCCCTATTCTTCAT 3′ 5′ GGAAGATTGTAGTGGTGAGGGT 3′ 3,961-3,980 4,033-4012
Ori-L long 5′ CAGCTAAGCACCCTAATCAACTGG 3′ 5′ TGGGAGATTATTCCGAAGCCTG 3′ 5,696-5,719 6,670-6,649
Ori-L short 5′ CAGCTAAGCACCCTAATCAACTGG 3′ 5′ CTTCAAACCTGCCGGGGCT 3′ 5,696-5,719 5,780-5,762
D-loop long 5′ CTGTTCTTTCATGGGGAAGC 3′ 5′ AAAGTGCATACCGCCAAAAG 3′ 16,021-16,040 424-405
D-loop short 5′ CCCTAACACCAGCCTAACCA 3′ 5′ AAAGTGCATACCGCCAAAAG 3′ 370-389 424-405

番号はGenBank™アクセッション番号HQ287896.1(Homo sapiens mitochondrion, complete genome)による。ただし、β-actin primer setはGenBank™アクセッション番号DQ407611(Homo sapiens, β-actin mRNA)による。 nps:ヌクレオチドポジション。

4.7. mtDNA損傷解析

mtDNAの損傷は、mtDNAの鎖切断、酸化的に修飾された塩基、および脱塩基部位の存在を検索して評価した。適用したqPCR法は、DNAポリメラーゼの進行の停止、あるいは鋳型上の病変の存在による増幅効率の低下に基づいており、その結果、DNA損傷とCtに到達するのに必要なサイクル数との間に正の相関関係が見られる[46,47]。アッセイの感度はアンプリコンの長さに依存するため[54],mtDNAの制御領域であるDループとL鎖の複製起点(Ori-L),および1つのコード領域(ND1/ND2遺伝子)を含む約1000bpの断片を増幅した(semi-long qPCR).分析したmtDNA領域からの短いアンプリコン(範囲55-84bp)を同時に増幅してDNAコピー数の変動をコントロールした後、2ΔCtの式に従って、未処理対照細胞に対する処理細胞のmtDNA病変の相対量を決定した(比較試料の短い産物の間に1Ct以上の差がないこと)。ΔCtは,処理した細胞と処理していない対照細胞の長尺アンプリコンのCt値の差である[46]。反応は、20ngの全DNAを鋳型として、SYBR Greenケミストリーにより行った。95℃で10分後、40サイクル(長鎖アンプリコンは95℃で10秒、60℃で60秒のアニーリングと伸長、短鎖アンプリコンは95℃で1秒、60℃で20秒のアニーリングと伸長)で増幅を進行させた。プライマーの配列については表1を参照。

4.8. アポトーシス

アポトーシスプロセスは、Muse Annexin V/Dead Cell kit(Merck-Millipore, Darmstadt, Germany)を用いて、供給元の指示に従ってMuse Cell Analyzerで評価した。

4.9. 統計解析

データは、処理した細胞と未処理のコントロール細胞との間で、One-way ANOVA分散分析およびDunnettの多重比較検定により解析した。すべてのデータは、少なくとも3回の独立した実験の平均とSEMで表した。p < 0.05で有意差があると判断した。統計解析には,特定のソフトウェアパッケージを使用した(Stata Statistical Software: Release 9; StataCorp LP, College Station, TX, USA)を使用した。)

5. 結論

ミトコンドリアは,細胞に電力を供給する役割や,細胞の代謝に影響を与える役割(栄養感知,代謝前駆体の合成,カルシウム調節,酸化還元調節の維持,細胞運命の決定など)のほかに [55],酸化ストレスにも関係している。この枠組みの中で、グリアジンのような酸化ストレス要因とこれらのオルガネラとの関係を理解することで、グルテン関連疾患の病態生理に関する知識を向上させることができる。