Contents
甘酒
matchaandtofu.com/how-to-make-perfect-amazake/
酒粕と米麹の混合物を摂取するとムチン濃度が上昇し、マウスの腸内細菌叢が変化することについて
Intake of a Mixture of Sake Cake and Rice Malt Increases Mucin Levels and Changes in Intestinal Microbiota in Mice
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7071214/
要旨
甘酒は日本の伝統的な飲料である。その主成分は酒粕と米麹である。本研究では、酒粕と米麹が腸管バリア機能と腸内細菌叢に及ぼす影響を調べた。BALB/cマウスに対照食、または酒粕と米麹の混合粉末（SRP）を含む食餌を4週間与えた。糞便IgA値は群間で変化しなかったが、糞便ムチン値はSRPを与えた群で有意に高かった。リアルタイムPCRによる回腸内の遺伝子発現解析では、Muc2の発現に変化はなかったが、SRP投与群ではMuc3の発現が上昇していた。さらに、マイクロバイオータ解析では、SRP摂取によるファミリーレベルでの変化が確認され、SRP摂取群ではラクトバシラス科の割合が有意に増加した。また、属レベルでは、ラクトバチルス属の割合もSRP摂取群で有意に増加した。以上の結果から、酒粕と米麹の混合摂取は、ムチン量を増加させ、腸内細菌叢の変化を誘導することで、腸管バリア機能を改善することが示唆された。
キーワード：酒粕、米麹、ムチン、マイクロバイオータ
1. はじめに
小腸の機能としては、食べ物の消化や栄養素の吸収などがある。また、腸は病原菌やその毒素にさらされている。このように、腸にはこれらの病原性因子から体を外部から守るための強固な免疫システムが備わっている[1]。腸管は、ムチンを主成分とする粘膜層で覆われている。ムチンと免疫グロブリンA（IgA）は、細菌の侵入や毒素を防ぐ腸管バリア機能を担う重要な成分である[2,3]。また、腸内環境因子として腸内細菌叢も重要であり、食事による栄養が腸管バリア機能や腸内細菌叢に与える影響も研究されている。食物繊維や一部のポリフェノール成分が腸内IgAやムチンの濃度を高め、腸管バリア機能を改善することが報告されており[4,5]、有名な発酵食品の一つであるヨーグルトが腸内マイクロバイオータに影響を与えることが報告されている[6]。
甘酒は、『日本書紀』に記載されている「天田酒」に由来する甘味のある日本の伝統的な飲料である。甘酒はその製造方法によって分類されている。「米麹甘酒」は米麹を使って糖化したもので、「酒粕甘酒」は酒粕を原料としたものである。また、日本では米麹と酒粕の両方を使った甘酒が広く消費されている。酒粕は酒造りの副産物で、伝統的には汁物（粕汁）や漬物（粕漬け）に使われていた。米麹は、蒸した米を菌類で発酵させて作られるもので、味噌や醤油などの伝統的な和食に広く使われている。甘酒には多くの栄養素が含まれているが、米麹甘酒には糖質、アミノ酸、有機酸、ビタミンB群など300種類以上の化合物が含まれている[7]。慢性肝疾患患者に多い栄養失調に対抗するために、米糀摂取による甘酒の臨床試験が行われた。この試験では、肝硬変患者に深夜のおやつとして甘酒を投与したところ、甘酒が患者のQOL（生活の質）を向上させる効果があることが示された[8]。
また、甘酒には消化されにくいタンパク質が含まれており[9]、高脂肪食を与えたラットでは、甘酒を摂取することで糞便中のIgAやムチンが増加し、望ましい微生物叢を形成することが報告されている[10]。酒粕には酒酵母の残留物が含まれており、多くの健康効果が得られる。以前に報告されたように、食用酵母の投与はマウスの乳酸菌の集団を増加させ、バクテロイデスを減少させる[11]。また、別の報告では、酵母の摂取によって腸内微生物組成が変化し、ラクトバチルス属は酵母を摂取した群でのみ検出されることが示されている[12] また、米麹由来のグリコシルセラミドの摂取によってマウスのBlautia coccoidesが増加することが報告されている[13]。これらの結果から、米麹と酒粕の両方から作られた甘酒は、整腸機能の改善が期待された。しかし、腸内環境に対する潜在的な健康効果は明らかにされていない。そこで本研究では、甘酒の主原料である酒粕と米麹を混合したものを摂取することが、腸内細菌叢だけでなく、腸内バリア機能に及ぼす影響を調べた。
2. 材料と方法
原文参照
3. 結果
原文参照
4. 考察
ここでは、甘酒の主成分である酒粕と米麹の混合物の摂取が腸管バリア機能に及ぼす影響を調べた。その結果、SRP食を4週間摂取すると、糞便ムチン量が増加することがわかった。腸管内の粘液層は物理的なバリアを形成し、病原性細菌や毒素などの潜在的な腔内攻撃から上皮細胞を保護している。ムチン欠乏モデルマウスは、粘膜の肥厚、結腸の炎症の亢進、および大腸炎への感受性の亢進を示した[21]。ムチン分泌を高めることで大腸炎からの保護を与えることができ、食事によってムチン分泌が改善されることを示した以前の報告[4,5,22]は、その証拠を与えている。小腸のムチン層の性質の変化がイオンの吸収に影響を与える可能性があることが報告されている[23]。本研究では、SRPの摂取により糞便ムチンが増加した。したがって、酒粕や米麹は、ムチン分泌を高めることで腸管バリア機能を改善する可能性があると考えられる。
回腸におけるムチン遺伝子発現の変化を調べたところ、Muc3 mRNAの発現はSRP摂取により有意に増加した。Muc3は腸内で発現する著名なムチン遺伝子の一つである[24]。Muc3は、杯細胞と腸球の両方で発現しており[25]、オルタナティブスプライシングを受けて、膜結合型または分泌型のタンパク質ファミリーをコードしている[26]。したがって、Muc3 mRNAのアップレギュレーションは、SRPマウス群の糞便で検出された強化されたムチン分泌に寄与する1つの要因であると考えられる。
SRP摂取による微生物叢の変化を調べた。SRP摂取後4週間後、SRP群ではラクトバチラス科、ポルフィロモナス科、プレボテラセア科の割合が科レベルで有意に増加していた。特にラクトバシラス科の割合は、SRP摂取により劇的に増加した。乳酸菌科は、腸内環境に有益とされる乳酸菌の一種である。属レベルでは、SRP群では対照群に比べて乳酸菌の個体数が有意に多くなってた。これらの結果は、酒粕には酒酵母の残留物が含まれていることから、酒粕や米麹がプレバイオティクスとして作用しうることを示唆している。同様に、食用酵母の一つであるCandida kefyrを投与すると、マウスの乳酸菌の集団が増加する[11]。したがって、清酒粕に含まれる清酒酵母の残留物は、ラクトバチルス属の個体数を増加させる可能性があると考えられる。また、SRP摂取によりPorphyromonadaceaeとPrevotellaceaeの割合も増加した。Barnesiella属は、Porphyromonadaceaeに属し、バンコマイシン耐性Enterococcusとの指示された腸管支配に対して抵抗性を示すことが報告されている[27]。また、SRP摂取によりBarnesiellaの割合も増加しており、SRP摂取によるPorphyromonadaceaeとBarnesiellaの変化は、耐性菌の感染を防ぐのに役立つかもしれない。Alloprevotellaはプレボテラ科に属する属であり、SRP摂取によりAlloprevotellaが増加した。しかし、腸内でのアロプレボテラの働きはよくわかっておらず、食物繊維の摂取によりアロプレボテラの割合が増加することが報告されている[28]。このようなSRP摂取による微生物叢の変化は、腸内環境の改善を通じて、腸管バリア機能の改善や私たちの全身の健康に貢献する可能性を秘めている。
腸内細菌は表面粘液層に存在する[29]。ムチン産生を促進するトランスジェニックマウスの研究では、ムチン層がより強固なものとなり、回腸内にラクトバチルス菌が有意に多く生息していることが明らかになった[30]。したがって、SRP 摂取によるムチン産生の促進は、腸内のラクトバチルス属の個体数を増加させる可能性があると考えられる。一方、ラクトバチルス・ラムノサスGG培養上清をラットに適用すると、ムチン産生がアップレギュレーションされ、大腸菌感染から保護されることが報告されている[31]。この結果は、SRPの摂取により腸内のラクトバチルス菌群が増加し、腸内のムチン分泌系に影響を与え、腸内のムチン分泌が亢進する可能性があることを示すもう一つの可能性を示している。腸内にはAkkermansia muciniphilaなどのムチン分解菌が存在する[32]。種レベルでの微生物叢解析は行われておらず、結論を出すことはできないが、Akkermansia属ではControl群とSRP群の間に有意な差は認められなかった。SRP摂取によるムチンの増加や微生物叢の変化の原因が何であるかは、今回の研究からは明らかになっていない。しかし、SRPの摂取により、ムチン産生とマイクロバイオータが相互に作用し、より良い状態を構成している可能性があると考えられる。
本研究では、マウスのSRP摂取によるムチン量の増加と微生物相の変化が観察された。また、酒粕と米麹の両方を含む甘酒を摂取することで、ヒトのムチン量を増加させて腸管バリア機能を改善し、有害な細菌や毒素から体を守ることができる可能性がある。このように、酒粕や米麹に含まれる成分の中には、腸内バリア機能を改善し、腸内環境を整える効果が期待できるものがある。しかし、本研究ではこれらの成分は解明されなかった。糖、有機酸、フェノール酸、アミノ酸などの多様な代謝物の生成は、米麹の糖化の過程で報告されている[33]。このような代謝物の中には、腸管バリア機能の改善を示す生理機能物質が含まれている可能性がある。食物繊維はムチン分泌を増加させることが報告されている[4]。SRPに含まれる食物繊維の詳細な成分は明らかにされていないが、SRPには食物繊維が含まれている。さらに、食物繊維の発酵後に大腸内で形成される短鎖脂肪酸もムチン分泌を増加させる[34]。このように、ムチン分泌に影響を与えるメディエーターが、SRP摂取によるムチン増強に寄与している可能性がある。酒粕や米麹に含まれる成分が腸管バリア機能や微生物叢にどのような寄与をしているのかを明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
魚沼佐慶乳酸菌による麹甘酒とその乳酸発酵物の代謝プロファイル
麹甘酒は日本の伝統的な甘味飲料である。日本では千年以上前から飲まれているが、麹甘酒に含まれる成分はほとんど知られていない。そこで本研究では、メタボロミクス手法を用いて麹甘酒の代謝物を解析することを目的とした。また、雪洞から分離された魚沼産乳酸菌を用いて、麹甘酒を乳酸発酵させて風味を改質した。本稿の目的は、これらの飲料に含まれる成分を特定することである。
LAFamazakeと麹甘酒では、2つの飲料に含まれる糖類、アミノ酸、有機酸、ビタミンB群を定量し、合計300種類以上の化合物を検出した。また、未知の三糖類2種を含む13種の糖類が確認され、両飲料間での差異は認められなかった。LAF甘酒では、乳酸、ビタミンB2（リボフラビン)B3（ニコチン酸、ニコチンアミド)B6（ピリドキシン）が麹甘酒に比べて有意に増加したが、リンゴ酸、グルタミンは減少した。
これらの結果から、LAF甘酒ではLAF、マロラクティック発酵、グルタミン脱アミド化が同時に起こっていることが示唆された。L. sakei UONUMA株はこれらのビタミンを産生していた。さらに、LAFamazakeでは、神経伝達物質としてよく知られているアセチルコリンが新たに生成されていたことにも驚いた。ここでは、麹甘酒の味の改良に成功し、2つの飲料についてこれらの代謝データを得ることができた。本研究は、健康のために麹甘酒とラー油甘酒の機能解析を進めるための基礎情報を提供することができると考えられる。
甘酒は日本の伝統的な甘味飲料である。甘酒には、調製方法により以下の2種類がある。米麹を原料としたもの（麹甘酒）と、酒粕を原料としたもの（酒粕甘酒）がある。特に麹甘酒は千年以上前から飲まれており、日本最古の歴史書である『日本書紀』にも登場している。麹甘酒は、蒸した米や水、場合によってはコック米にアスペルギルス・オリザエが生育した米麹を原料として製造されている。
麹甘酒のブドウ糖濃度は約20%に達するが、これは米麹に含まれるデンプンがA.オリザエが産生するアミラーゼやグルコアミラーゼなどの酵素によって糖化されているためである。麹甘酒中の糖類、アミノ酸、有機酸の含有量はこれまでに報告されている（1e3）。しかし、その他の成分についてはほとんど知られていない。機能解析では、大浦ら(4)が、食物繊維やペプチドに起因すると思われる抗肥満、抗高血圧、抗アムネス作用を報告している。最近の研究では、晩酌として麹甘酒を摂取することで肝硬変患者の自覚症状が改善されたという報告がある(5)。
この報告では、麹甘酒に含まれる分岐鎖アミノ酸が肝硬変患者の肝臓の局所免疫系に影響を与えると結論づけている。このように、甘酒の健康への効果は広く研究されていたが、その機能性物質についてはまだ明らかになっていない。そのため、甘酒の代謝物を調べて、健康に影響を与える機能性物質を探ることも重要である。
そこで、新潟県魚沼地方の雪洞で日本の漬物から分離された乳酸菌（Lactobacillus sakei UONUMA株）を用いて、乳酸発酵による麹甘酒の風味や成分の改質を試みた（6）。乳酸菌とその発酵産物は、脂質代謝の改善(7)、血圧の低下(8)、免疫調節(9)などの健康への有益な効果を含めて注目されていた。L. sakeiは精神栄養性乳酸菌であり、酒造のみならず、ドライソーセージや肉・魚介類の製造にも重要な役割を果たしている。さらに、L. sakeiは、バイオ保存(10)や免疫調節のためのバイオテクノロジーの可能性を持っている。増田ら（11,12）は、L. sakei LK117株がIL12p40産生を持続的に増加させ（11)NC/NgaマウスのIgE血漿レベルに依存しない方法でアトピー性皮膚炎様皮膚病変の発症を減少させたことを報告している（12）。
本研究の目的は、スクリーニング法としてメタボロミクスアプローチを用いて、麹甘酒と乳酸発酵甘酒（LAFamazake）の代謝産物を同定することであった。これらの代謝データは、麹甘酒および乳酸発酵甘酒の健康機能解析の推進に役立つと考えられる。
材料と方法
原文参照
結果と考察
省略
糖類 麻生ら(Aso er al)。 (1)は、単糖類としてグルコース、二糖類としてマルトース(Glc(a14)Glc)、イソマルトース(Glc(a16)Glc)、ニゲロース(Glc(a13)Glc)、コジビノース(Glc(a12)Glc)を報告している。三糖類としてイソマルトトリオース（Glc（a16）Glc（a16）Glc)パノース（Glc（a16）Glc（a14）Glc）があり、麹甘酒ではより高いオリゴ糖が検出された。また、麹甘酒とLAF甘酒に含まれる糖類を測定したところ、表2のような結果が得られた。また、これら7種類の糖も同定したが、四糖よりも長い高位オリゴ糖は検出されなかった。A. oryzae のアミラーゼの一部は、直鎖状、らせん状のアミロースと分枝状のアミロペクチンからなり、米のデンプンをグルコース、マルトース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノースに消化していた。さらに、グリコシルトランスフェラーゼはニゲロース、コジビオースを生成した。さらに、二糖類としてトレハロース（Glc(a11)Glc)ソフォロース（Glc(b12)Glc)ゲンチオビオース（Glc(b16)Glc)二糖類としてラフィノース（Gl(a16)Glc(b12)Fru)三糖類としてこれまでに報告されていない未知の二糖類を麹甘酒中に同定した。A. oryzae はコニディア中にトレハロースを蓄積していることが報告されており(19)、麹の製造過程でトレハロースが生成されている可能性がある。アーモンドやPenicillium funiculosumからのグルコシダーゼによるソフォロースやゲンチオビオースの生成が報告されており（20)A. oryzaeも同様の反応で生成される可能性があると考えられる。二糖類の中にはカラメル化によって生成するものがあることが知られているが(21)、麹甘酒の製造過程では高温の工程がないため、酵素的に生成されていると考えられる。標準品との比較の結果、マルトトリオースを含まない未知の三糖が2つ確認された。LAFamazakeでは、糖組成は麹甘酒と同じであった（表2）。L. sakei UONUMA株は様々な糖を発酵させることができたが（表1)麹甘酒では主にグルコースを異化していた。
アミノ酸 甘酒麹に含まれるアミノ酸は、米蛋白質をオリザエ由来の酸性プロテアーゼと酸性カルボキシペプチダーゼで分解して生成したものである(22)。Tukiyamaら（3）は、トリプトファン、グルタミン、アスパラギンを除く遊離アミノ酸が甘酒麹中に存在することを報告している。試験した麹甘酒とLAFamazakeから検出された遊離アミノ酸を表3に示す。グルタミン酸（Gln）以外の遊離アミノ酸の含有量は、麹甘酒とLAFamazakeの間に差はなかった。LAFamazakeは麹甘酒に比べてGlnが有意に減少していた。L. sakei UONUMAはGlnの脱アミド化からNH3により細胞内pHを維持している可能性がある(23)。実際、LAFamazakeではGluが増加する傾向があった。NH3によるpHの維持は、アルギニン脱アミノ化酵素（ADI）経路としても知られている。オルニチン（Orn）は、L. sakei（25）を含む乳酸菌（24）のADI経路の主要産物である。L. sakei UONUMAもOrn産生能を有しているが（データは示されていない)Gln脱アミド化経路が優先的に利用されている可能性が考えられる。
有機酸 報告されている麹甘酒およびラファマザックの有機酸含量を表4に示す。Tukiyama ら（3）は、麹甘酒に最も多く含まれる有機酸はクエン酸であり、次いでフマル酸、酢酸、リンゴ酸、コハク酸の順であったと報告している。今回使用した麹甘酒の有機酸含有量は、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、ピルビン酸の順で最も多く、次いでフマル酸の順であった。酢酸、乳酸ともに検出されなかった。麹甘酒では、ラファ甘酒と比較して、ピルビン酸、クエン酸、フマル酸、コハク酸の含有量に大きな差はなく、酢酸も検出されなかった。乳酸は、LAF甘酒では新たに発生していた。逆にリンゴ酸は麹甘酒では5.3mg/100mLであったが、LAFamazakeでは検出されなかった。これらの結果から、L. sakei UONUMAはLAFだけでなく、マロラクティック発酵（MLF）も行っていることが示唆された。MLFは、リンゴ酸が乳酸に変換されるワイン醸造における酸度低下の重要なプロセスである(26)。ワイン醸造に重要なMLF菌としては、オエノコッカス・オエニがよく知られており、また、ラクトバチルス・プランタルムやL.サケイもMLF菌であることが報告されている(27)。LAF甘酒のpH値は25℃で24時間後にpH5.5から3.9に達したが、これは主にLAFとMLFからの乳酸の蓄積によるものである。
可溶性ビタミン 米麹には、チアミン（B1)ナイアシン（B3)パントテン酸（B5)B6などの可溶性ビタミンB群が含まれていることが知られている（28,29）。そこで、麹甘酒とラファ甘酒に含まれると予想されるビタミンB群を分析したところ、表5に示すように、麹甘酒にはB12を除くビタミンB群が検出された。しかし、ビタミンCは検出されなかった。驚くべきことに、LAFamazakeではB2,B3,B6の量が有意に増加していた。この結果から、L. sakei UONUMAはこれらのビタミンを産生する可能性があることが示唆された。L. sakeiは細胞外でB9を多く産生することが報告されている(30)が、その他のビタミンB群の産生についてはほとんど報告されていない。一方、L. plantarumはB1(30)とB2(31)、Lactobacillus reuteriはB12(コバラミン)を産生することが報告されている(32)。したがって、L. sakeiもB2,B3,B6を産生する能力を持っている可能性がある。逆に、LAFamazakeではB1とB7が有意に減少しており、L. sakei UONUMAがこれらのビタミンを消費していることが示唆された。
その他の化合物 本研究では、CETOFMSとLCTOFMSを用いて、麹甘酒とLAFamazakeから表S2に示す合計366種類の化合物を検出した。このうち、173化合物はアノテーションされた既知化合物であり、187化合物はHMTライブラリーデータベースを参照してオリゴペプチド（2e4アミノ酸残基）であると予測され、6化合物は未知であった。このうち、麹甘酒でのみ検出された化合物は43化合物、LAFamazakeでのみ検出された化合物は14化合物であった。一次スクリーニングとしてメタボローム解析を行い、EGT、Ach、セロトニンの存在を確認した。
その結果、EGT（エルゴチオネイン）は麹甘酒では818.6±1.1 μg/100 mL、LAFamazakeでは470.1 5±4.1 μg/100 mLで検出された。EGTは有効な抗酸化物質として知られており、活性酸素、窒素種、紫外線照射によって誘発される損傷からヒトの細胞を保護する(33)。EGTは、放線菌(34)、藍藻(35)、アスコミコータ(36)、担子菌(37)などの特定の真菌類をはじめとする比較的少数の生物で発見されている。Aspergillus fumigatusもEGTを産生しており、EGT合成の鍵となる酵素EGTAが決定されている(38)。BlastPプログラムとAspGDを用いて、A. oryzae RIB40のゲノム中にEGTAのオルソログがAO090012000265として発見された（http://www.aspergillusgenome.org/）。このことから、甘酒麹のEGTはA. oryzaeによって産生されたと考えられる。一方、EGTはLAF後に減少した。
LAF甘酒では、図1に示すように、LAFによりAChが新たに生成されたが、麹甘酒ではAChは存在しなかった。L. plantarumは成長中にAChを産生することが報告されている(39,40)。Kets er al)。
(41)は、AChとChが浸透圧ストレスに応答する浸透圧物質である可能性を報告している。Chから作られるBTは、大腸菌において高いレベルの浸透圧耐性を付与することが発見されている(42)。また、BTは、Lactobacillusにおいて、Glnなどの特定のアミノ酸によるような様々な浸透圧ストレスに対応する浸透圧ストレス耐性を有することが知られている(41)。LAFamazakeはBTを有意に蓄積したが、Ch（図1）やアミノ酸を蓄積しなかった（表3）。
残念ながら、セロトニンの産生は確認できなかった。いずれの飲料でもセロトニンは産生されていないと考えた。この研究の限界は、食物摂取量の強力かつ持続的な減少を引き起こし（43)麹甘酒と比較して2倍以上に増加したオレオイルエタノールアミン（表S2）をはじめとする新規に生成した化合物が少なく、検証できなかったことである。近い将来、これらの化合物の含有量を検証する必要がある。
麹甘酒と LAF 甘酒の風味の違いの比較 麹甘酒と LAF 甘酒の風味評価は味覚感知システム TS5000Z を用いて行った。このシステムは、人間の舌と同様の反応を一貫して行う人工脂質膜をベースに、苦味、うま味、塩味、酸味、渋味、甘味を認識するものである。図2は、参考にしたLAF甘酒と麹甘酒の味の違いを示したものである。LAF甘酒では、LAFが産生する乳酸の影響で酸味が強く変化していた。甘味は、麹甘酒に比べてLAF甘酒の方がわずかに減少した。しかし、麹甘酒とLAF甘酒の糖度にはほとんど差がなかった。これは酸味が強いためと考えられ、塩味やうま味を減らしても同様の効果があると思われる。このように、主にLAFにより麹甘酒の酸味を改善することに成功した。
本研究では、麹甘酒とLAF甘酒の糖類、アミノ酸、有機酸、ビタミンB群の組成を実証した。また、麹甘酒の風味を改質することに成功し、LAFにより新たに生成したAchなどの化合物の同定にも成功した。今回の研究は、麹甘酒とLAF甘酒のヒトの健康における機能解析を進める上で有用な情報を提供できる可能性がある。