活性化か抑制か?アルツハイマー病治療戦略としてのオートファジー制御の意義

強調オフ

オートファジー

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Activate or Inhibit? Implications of Autophagy Modulation as a Therapeutic Strategy for Alzheimer’s Disease

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7554997/

要旨

神経変性疾患は、プロテインオパチーの種類、影響を受ける遺伝子、または脳内の変性の場所によって様々な状態になる。脳内の老人斑や神経原線維のもつれなどのプロテインパチーは、アルツハイマー病の顕著な特徴である。

オートファジーは、機能不全の小器官やタンパク質を排除する高度に制御された機構であり、これらの病原性のある細胞内タンパク質凝集体を除去するために重要な役割を果たしており、アルツハイマー病のみならず、他の神経変性疾患においても重要な役割を果たしている。

オートファジーを活性化することは、アルツハイマー病を含む慢性疾患の治療戦略として注目されている。オートファジーの活性化は有望な治療法であるが、リソソームクリアランスに障害がある神経変性疾患では、オートファジーの過剰活性化が病態を加速させる可能性があり、オートファジーに基づく治療法の成功は、リソソームクリアランスが機能的であることに依存していることが示唆されている。

さらに、オートファジー活性化の効果は、細胞の生理的状態、特にプロテオティックストレスや加齢に応じて大きく変化する可能性がある。阻害された特定のプロセスの障害を予防または逆転させることにより、オートファジーの有効性を高める戦略を支持するエビデンスが増えているようである。

したがって、さまざまな神経変性疾患におけるオートファジー障害の根本的な原因を理解することは、治療法の可能性を探る上で不可欠である。本レビューでは、ストレスや加齢に伴うオートファジーの役割、その活性化と関連した結果、治療としてこの経路を調節する際の注意点に焦点を当てる。

キーワード

βアミロイド、オートファジー、クリアランス、毒性、リソソーム、アルツハイマー病、老化、ストレス応答、アポトーシス

1. はじめに

加齢に伴い、タンパク質の恒常性を維持する細胞の能力、すなわちプロテオスタシスが低下し、この自然な低下は、すべての神経変性疾患において特徴的に悪化する [1]。細胞の生存、成長、増殖は、タンパク質合成、折り畳み、輸送、凝集、分解のバランスに依存している。プロテオームを構成する個々のタンパク質の構造、結合相互作用、位置、濃度を制御することが、プロテオームを維持する細胞の役割を果たしている[1]。

タンパク質の折り畳みは、折り畳みポリペプチド鎖と、複数のクラスのシャペロン、折り畳み酵素、標的化された分解経路などの高分子細胞成分との相互作用によって達成され、タンパク質の凝集を最小限に抑えることができる[2]。ヒトの機能喪失疾患は、多くの場合、正常なプロテオスタシスの障害の結果であり、典型的には関連遺伝子の突然変異によって引き起こされ、それによってタンパク質の折り畳みが損なわれる。

対照的に、機能獲得疾患は、アルツハイマー病におけるβアミロイド(アミロイドβ)のような有毒なタンパク質凝集体の蓄積につながる、誤って折り畳まれたタンパク質を分解する能力の低下につながるプロテオスタシスの破壊の結果として発生する可能性がある[3]。

マクロオートファジーは、飢餓によって誘導されるオートファジーのバルク分解機構であり、タンパク質凝集体のクリアランスと損傷を受けた小器官の除去に重要である。マクロオートファジーは、非選択的にビルディングユニットの利用可能性を再生することで、栄養素の不足を補うことを助けている[4]。

しかし、オートファジーはまた、損傷した小器官や特定のタンパク質に対して高度に選択的であることができ、アルツハイマー病のようなタンパク質のミスフォールディング疾患のための重要な治療アプローチである。オートファジーの活性化は、したがって、アルツハイマー病の魅力的な治療戦略である。

しかし、この経路の過剰な刺激は、基礎となるプロテオスタシスの機能不全を持つ細胞にとって有害であり、潜在的に致命的である可能性がある。

ここでは、プロテオスタシスを調節する保護経路としてのオートファジーの役割と、アルツハイマー病における神経変性の促進におけるその病原性の役割について検討する。また、オートファジー経路の活性化または阻害がアルツハイマー病の治療戦略として最善の可能性を持つかどうかについても議論する。

2. オートファジーのプロセス

オートファジーは選択的オートファジーと非選択的オートファジーに分類される。

選択的オートファジーには、マイトファジー(ミトコンドリア)リボファジー(リボソーム)リソファジー(リソソーム)ペキソファジー(ペルオキシソーム)リポファジー(脂質滴)グリコファジー(グリコーゲン)アグレファジー(誤ったタンパク質)ゼノファジー(感染した病原体)およびレティキュロファジー(小胞体)が含まれる[5]。p62のようなオートファジー「カーゴ」受容体は、オートファジー分解のための特定のカーゴを認識する[6]。逆に、非選択的オートファジーは、細胞質のランダムな部分とその構成要素の消化を伴う。

オートファジーは細胞の恒常性を維持し、通常、栄養飢餓、未展開タンパク質の存在、ウイルス感染、酸化ストレスなどのストレス条件下で誘導される。栄養素シグナル伝達は、mTOR(ラパマイシンの哺乳類標的)およびCCI-779またはラパマイシンのようなmTORの直接的または間接的な阻害を伴う治療戦略によって制御される。しかしながら、アミノ酸の欠乏は、mTOR非依存性オートファジーのタンパク質分解を促進し得る[8,9]。特定のアミノ酸の欠乏はオートファジーを刺激することができるが、細胞タイプと欠乏しているアミノ酸のタイプに依存する。さらに、AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)[10,11]およびBcl-2(B細胞リンパ腫2)[12]のような他の因子がオートファジーに影響を与える可能性がある。

簡単に言えば、オートファジーのプロセスには、オートファゴソームの形成が含まれており、オートファゴソームは、誤って折り畳まれたタンパク質、長寿命のタンパク質、小器官を封じ込めた細胞質の一部をカプセル化し、リソソームと融合して基質の分解を可能にする。オートファゴソームの形成は、図1に示すように、小器官を含む細胞質成分を取り囲むファゴフォアと呼ばれる二重膜オルガネラの開始を伴う[12]。その後、オートファゴソームはリソソームと融合し、オートファゴソームの内膜が加水分解されて細胞質由来成分が放出される。分解された高分子は、その後、再利用するために細胞質に戻される [12]。選択的オートファジーでは、オプティニューリンやp62などのオートファジー受容体は、それぞれUBAN(ABINタンパク質やnemoにおけるユビキチン結合ドメイン)やUBA(ユビキチン関連)ドメインを介して、分解のためにユビキチン化されたタンパク質を認識し、それらをファゴフォアに輸送する [13]。オートファジー受容体は、その後、LC3相互作用領域(LIR)によって媒介される軽鎖3(LC3)との相互作用を介してオートファゴソーム膜に結合する。

図1 オートファジーにおけるファゴフォアの形成

上図は、マクロオートファジー時の二重膜構造の形成を示す。

SQSTM1/p62のドメイン;PB1(PhoxおよびBemp1)ZZ(ジンクフィンガー)T6B(腫瘍壊死因子受容体関連因子6結合)LIR(LC3相互作用領域)KIR(Kelch-like ECH associated protein 1 interacting region)UBA(ユビキチン関連)。OPTNのドメイン;コイル状コイル(CC1-3)LIR、UBAN(ABINタンパク質およびNEMOにおけるユビキチン結合ドメイン)ZZ(ZZ型ジンクフィンガー)。


中枢神経系におけるプロテオスタシスの維持におけるオートファジーの重要な役割の証拠は、オートファジーの機能不全が、アルツハイマー病における神経変性につながる高リン酸化タウとアミロイドβの凝集を含む誤ったタンパク質の蓄積に寄与していることを示す研究によって実証されている[14,15]。Atg7やAtg5などの重要なオートファジー遺伝子の阻害は、阻害が完全か選択的かによって異なる結果をもたらす。完全な阻害は新生児マウスの死亡率を引き起こし、選択的な阻害は神経変性疾患を彷彿とさせる表現型をもたらすことが示されている[15]。

シャペロン媒介オートファジー(CMA)の阻害は、高リン酸化タウタンパク質で構成される神経原線維のもつれの発生に寄与する。リソソーム関連膜タンパク質2a型(LAMP-2A)に結合したタウタンパク質は、リソソーム膜に影響を与えるだけでなく、CMAのメカニズムを阻害している[16]。脳内のレギュレーター・オブ・カルシニューリン1(RCAN1)のレベルの増加は、アルツハイマー病におけるCMAの障害をさらに実証している[17]。

3. ストレス応答経路としてのオートファジーの役割

真核細胞は、温度、イオン濃度、酸素濃度、pH、微生物病原体など、ストレスを誘発する外部条件の変化に継続的に適応しなければならない。さらに重要なことは、細胞は常に不要な高分子や細胞の老廃物を除去することによって細胞内の恒常性を維持する必要があり、その蓄積は、アルツハイマー病や多くの神経変性疾患の特徴である。

ある閾値を超えると、そのような変化は、このストレスに対する細胞の反応が、細胞が効果的に機能し、生き残ることができるかどうかを決定することを意味し、”ストレッサー “になる(図2)。

オートファジーは、複数のストレス因子に応答して細胞の生存を促進し、変性疾患、炎症性疾患、感染症からの防御を助ける重要な防御機構を構成している[18,19]。オートファジーは、栄養ストレスやエネルギーストレス、タンパク質毒性ストレス、病原体関連分子パターン(PAMP)低酸素、ミトコンドリア損傷など、さまざまなストレス刺激によって誘発される可能性がある[20]。

図2 細胞のストレス応答経路とオートファジーおよびアポトーシスの調節

上図は、オートファジーを活性化する様々なストレス応答を表したものであり、細胞の生存またはアポトーシスを受ける能力を決定するストレスのレベルを示している。


栄養素の枯渇または飢餓は、オートファジーの最も強力な生理的誘発因子である[21,22]。いくつかの重要な分子が飢餓誘発オートファジーを制御している;これらのうち、キナーゼであるmTORとAMPKを介した栄養シグナル伝達経路が最も特徴的である。

アンフォールドタンパク応答(UPR)[23]は、タンパク質の凝集と毒性に応答してオートファジーを強力に刺激する。UPRは、PERK(PKR様eIF2aキナーゼ)ATF6(活性化転写因子-6)およびIRE1(イノシトール必要酵素1)によって媒介され、これらはすべてシャペロン結合免疫グロブリンタンパク質(BiP/GRP78)によって制御される。BiP/GRP78は、誤って折り畳まれたタンパク質に結合することで、PERK、IRE1,ATF6を阻害剤から放出し、オートファジーを活性化させる。このうち、PERKとATF6はオートファジー誘導因子として作用し、IRE1はオートファジーの負の調節因子として作用する[24]。

 

微生物感染は、オートファジー誘導をもたらす細胞ストレスの特化した形態を構成している[25]。感染中のオートファジー活性化は、インターフェロンγ(IFN-γ)や病原体の保存成分(PAMP)を認識する病原体認識受容体(PRR)などのサイトカインによって制御される[26]。さらに、PRRは、PAMP、壊死細胞、低酸素、活性酸素種(ROS)およびミスフォールドタンパク質の蓄積を認識する。低酸素(酸素濃度が3%未満の場合)もまた、様々な異なるメカニズムを介してオートファジーを誘導する。低酸素誘導オートファジーは低酸素誘導因子(HIF)に依存するが、無酸素誘導オートファジーはHIFに依存しない [27,28]。

 

ミトコンドリアの損傷もまた、オートファジーの強力な誘導因子であり、損傷したミトコンドリアがオートファジーの標的となるメカニズムの理解と、老化や神経変性疾患、その他の病態の予防におけるミトコンドリアの品質管理の機能的意義については、かなりの進歩が見られている。細胞は、活性酸素の蓄積を防ぐために、損傷したミトコンドリアをマイトファジーによってクリアする。損傷したミトコンドリアのオートファジーによる認識は、ミトコンドリアキナーゼであるPINK1によって媒介される[29]が、ミトコンドリアの完全性の維持にも重要な役割を果たしている[30]。これらの刺激によるオートファジーのアップレギュレーションには、オートファジー、細胞ストレス応答、細胞死経路においてしばしば重複する機能を持つ多様なシグナルが関与しており、これらについてはで議論する。

4. オートファジーの二重の役割:オートファジーとアポトーシスのクロストーク

オートファジーは中枢神経系(中枢神経系)で構成的に活性化されており [31]、欠陥のあるタンパク質や小器官を排除し、タンパク質の凝集体の蓄積を防ぎ、エネルギー需要を維持し、神経細胞の可塑性をサポートすることで恒常性を維持するのに役立っている [32,33]。オートファジーは神経保護作用を持つことが証明されており[34]、これはニューロンのようなミトコンドリア化後の細胞において特に重要である[13,35]。ニューロンには、高エネルギーとタンパク質のターンオーバーを必要とする軸索やシナプスなど、神経伝達のための多くの特殊な細胞プロセスがある。ニューロンにおけるオートファゴソームの形成は、遠位軸索で起こり、ソーマへの逆行性トラフィッキングを受けるため、ニューロンにおけるオートファゴ小胞のトラフィッキングは非常に長くなる可能性がある。したがって、ニューロンは、オートファゴソームやオートファゴ小胞(AV)の蓄積を誘導するオートファジー-リソソソームトラフィッキングの欠陥や軸索損傷に対して特に敏感である[36]。

オートファジーはプログラムされた細胞死またはアポトーシスと密接に関連しており、主にミトコンドリア膜透過(MMP)によって開始される [31]。脱分極したミトコンドリアの選択的なオートファジー除去またはマイトファジーは、ミトコンドリアのごく一部がMMPを表示する場合に発生する。しかし、細胞タイプやストレスの性質によって異なるマイトファジーのある閾値を超えると、MMPは取り返しのつかない致命的なイベントを構成する。活性化されたオートファジータンパク質複合体からアポトーシス制御タンパク質Bcl-2が解放されると、これらの分子が解放されてアポトーシスの経路を遮断する可能性があることは、もっともらしいことである[17]。オートファジーの主に細胞保護的な役割を考えると、アポトーシスの誘導はオートファジーの不活性化と結びついている可能性が高いと思われる。例えば、カスパーゼ-3はベクリン-1を切断し、それによってそのプロオートファジー活性を破壊する。この切断によって生じるベクリン-1のC末端フラグメントは新たな機能を獲得し、ミトコンドリアを介したアポトーシスを増幅させることができる[37]。カスパーゼ-3の活性化はまた、LC3パラログGABARPL1の脱脂質を触媒する酵素であるAtg4Dを切断し、活性化する。このタンパク質分解活性化は、仮説的なBH3ドメインを介してミトコンドリアへのAtg4Dのリクルートを増加させ、その細胞毒性活性を高める[38]。同様に、カルパインのタンパク質分解活性は、Atg5のプロオートファジー機能を破壊することができる[39]、プロアポトーシスのミトコンドリア透過性Atg5フラグメントを生成する[40]。

オートファジーは一般的にプロ生存メカニズムと考えられているが、オートファジーとアポトーシスは相互に依存している。オートファジーの障害は神経細胞のアポトーシスの増加を引き起こす [41]。

オートファジーは、過剰な活性化の結果として細胞死を促進することと関連しており[42]、また、細胞の排除や神経細胞の興奮毒性[43,44,45]の際にも関連している。

いくつかの研究では、マウスの低酸素/虚血性脳損傷や線虫の壊死性細胞死などでオートファジーの阻害が神経細胞の生存率を高めることが示されている[46,47,48]。オートファジーの過剰な活性化と長期的なオートファジーのアップレギュレーションは、最終的には自己消化につながると考えられている[49,50,51]。細胞死におけるオートファジーの役割および関与する詳細なメカニズムはまだ不明であり、オートファジーによる細胞死がアポトーシスに関連しているのか、それとも別個のプロセスであるのかは議論されている[18,34,52]。特筆すべきは、アポトーシスとオートファジーには、Beclin-1,Bcl-2,p53,Atg5などの共通の調節因子があり、これらは神経細胞死を促進するために相互作用している可能性があるということである [19,53]。これらの知見をまとめると、オートファジーとアポトーシスは、複数の共有シグナル伝達経路と制御プロセスに相互に依存していることが明らかになった。

5. オートファジーと老化

加齢はアルツハイマー病の最も重要な危険因子である。加齢はすべての生物に起こる自然現象であり、オートファジーを含む修復プロセスの低下を構成し、ダメージの蓄積と細胞機能の漸進的な低下をもたらす。多くの生物は加齢とともにオートファジー能力の低下の兆候を示しており、抗老化メカニズムとしてのオートファジーの役割を支持する証拠が増えている。

加齢に伴うオートファジーおよびリソソソームプロテオライシスの減少は広範囲に報告されている([54]でレビューされている)。電子顕微鏡による研究と代謝アッセイにより、プロテオームの分解率とオートファジー刺激に対する感受性が加齢とともに低下することが明らかになった([55,56])。

ホルモンによるオートファジーの制御もまた、年齢によって異なる影響を受ける([57])。高齢化したげっ歯類の様々な組織から分離されたリソソームは、細胞質基質タンパク質の結合および取り込み能力が低下していた。興味深いことに、基質の分解は加齢によって変化しないことから、リソソソーム酵素の活性は加齢によって維持されていることが示唆された([58])。

CMAもまた、加齢とともに低下する。CMAのメカニズムに不可欠なLAMP-2A受容体の減少は、リソソームへの基質の結合が阻害されることで、タンパク質分解の速度や細胞保護機能に影響を与えると言われている。さらに、リソソソーム膜のコレステロール濃度は、LAMP-2A遺伝子のレベルに影響される[59]。

また、転写因子EB(TFEB)のようなオートファジーに関連する転写因子の効率も、加齢によるオートファジーの低下に寄与している[60]。最近の研究では、TFEBの過剰発現が長寿につながることが示されている[59]。

 

オートファジー遺伝子のノックアウト(KO)または誘導を含む数多くの研究は、老化におけるオートファジーの重要性をさらに明らかにしている[61]。Atg5を過剰に発現させると、Atg5トランスジェニックマウスのオートファジー、無気力、インスリン感受性、運動機能が向上し、寿命が延びることがわかった [62]。LAMP-2Aレベルの低下を抑えるとオートファジー活性が維持され、マウスでは損傷を受けたタンパク質の蓄積が減少し、臓器機能が改善された [63]。線虫の線虫モデルであるCaenorhabditis elegans [64]では、Atg18; daf-2二重変異体の神経細胞におけるAtg18の発現を回復させることで、これらの動物の寿命の短縮が完全に救われた [65]。さらに、いくつかのオートファジートランスジェニックマウスモデルでは寿命が延長しているが、その背景にある分子機構や老化との関連は不明である[66]。必須のAtg遺伝子の組織特異的なアブレーションは老化の早期兆候を示し、特異的なAtg5またはAtg7のKOは神経変性を引き起こす[67]。特定の遺伝子の発現レベルは、オートファジーと寿命延長の調節に重要な役割を果たしている。サーチュイン1(SIRT1)の過剰発現はオートファジーを活性化し、細胞モデルと動物モデルの両方で老化を遅らせ、長寿を促進する[59]。さらに、オートファジーの重要な調節因子であるベクリン-1の血清濃度がヒトの長寿と関連していることが臨床所見で示されている[68]。この研究では、健康な100歳代の人のベクリン-1濃度は若年者と比較して有意に高かった。

 

寿命延長に加えて、オートファジーと認知機能の改善との関連性も研究されている [69,70,71]。多くの研究で、オートファジーが主な危険因子である老化に関連する神経変性疾患が調査されている [72,73]。ほとんどの神経変性疾患には、誤ったタンパク質と損傷した小器官の特徴が共通しており、これらの蓄積は適切な軸索輸送を阻害し、神経毒性をもたらす。

オートファジーまたはCMAのいずれかの障害は、樹状突起と軸索のリモデリングを阻害し、したがって、神経細胞の可塑性を低下させる [74,75]。アルツハイマー病では、オートファゴソームによって分泌される細胞外アミロイドβプラークが細胞間のコミュニケーションを妨害することがある[75]。記憶形成における加齢に関連した衰えは十分に確立されており、上記の知見は、オートファジーの低下が加齢に伴う認知機能の低下に寄与するというモデルを支持するものである。

しかし、オートファジーが加齢に伴う脳機能にどのように寄与しているのか、その根本的なメカニズムはよく理解されていない。オートファジーは、老化に寄与する中枢神経系の多くのプロセスにおいて重要な役割を果たしており、その中には、長寿命で凝集しやすい細胞質タンパク質や損傷した小器官のクリアランスなどが含まれており、神経細胞の完全性を維持し、老化中の生存を促進することができる。

6. アルツハイマー病におけるオートファジー遺伝子の役割

アポリポ蛋白E4(ApoE4)は散発性アルツハイマー病の主な遺伝的危険因子である[74,76]。アポE4は脂質の恒常性維持に不可欠であり、それはオートファジーを介したクリアランスにも及ぶ;しかしながら、数十年に及ぶ研究にもかかわらず、アルツハイマー病発症へのアポE4の寄与の根底にある正確なメカニズムは未だに不完全に定義されている。オートファジープロセスを変化させる遺伝的危険因子は、他の神経変性疾患(例えば、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭変性症)にも関与している[77]。これらのすべてのケースにおいて、オートファジーによる効率的な分解の欠如は、軸索輸送機能不全を誘発する凝集したタンパク質の長期的な存在をもたらす[78]。

オートファジー受容体遺伝子であるSQSTM1,OPTN、UBQLN2,オートファジー調節遺伝子であるVCP、TBK1の変異は、前頭側頭部変性症や筋萎縮性側索硬化症と関連している[79]。これらのうち、SQSTM1の変異はアルツハイマー病症例でも報告されている[80]。SQSTM1イントロニックバリアントとアルツハイマー病とのサブゲノムワイドな関連を明らかにしたメタアナリシスに続いて、若年性アルツハイマー病(若年性アルツハイマー病)またはアルツハイマー病の陽性家族歴を持つ患者のフランドル・ベルギーのコホートを対象とした標的配列決定が行われた。合計 61 の SQSTM1 エキソニックバリアントが報告され、そのうち 57 が希少バリアントであった。希少バリアントの負荷解析では、対照群と比較して患者における頻度の増加は明らかにされなかったが、2つの一般的な同義バリアントはアルツハイマー病との名目的な関連性を示した [80]。若年性アルツハイマー病患者1253人と対照者2117人におけるTBK1遺伝子の標的的リシークエンスにより、32のレアバリアントが明らかになり、そのうちの1つは機能喪失突然変異であった。特定された 31 のミスセンス変異のうち、7 つは患者に限った変異であり、そのうちの 4 つは複合アノテーション依存性枯渇(CADD)Phred スコアが 20 を超えており、これは病原性を示す可能性があった。しかし、コントロールに特異的な変異体や共有変異体も高い(>20)CADD Phredスコアを有しており、コントロールに比べて症例では希少な変異体の濃縮は観察されなかった[81]。OPTNやUBQLN2のバリアントとアルツハイマー病との関連についての報告はない。しかし、最近の研究では、若年性アルツハイマー病患者のVCPにおける意義不明のバリアントが同定された[82]。アルツハイマー病患者の小脳と側頭皮質からのトランスクリプト解析では、以前に骨のパジェット病と関連していたOPTN一塩基多型がOPTN発現の増加と関連していることが強調された [83]。全体的に、アルツハイマー病におけるオートファジー受容体遺伝子またはその調節因子の重要な役割は支持されていない。

 

アルツハイマー病で報告された遺伝子関連の最近のレビューでは、40以上の遺伝子の潜在的な関与または確認された関与が強調されており[84]、これらのいくつかはオートファジーに役割を持っている。

  • TREM2はmTORの調節を介してミクログリアの代謝を促進することが示されている[85]。
  • EPHA1のサイレンシングはオートファジーを阻害する [86]。
  • プロテオスタシスに関与するシャペロンであるClusterinは、プロサバイバルオートファジー[87]、LC3脂質化およびオートファゴソームバイオジェネシス[88]に必要である。
  • PICALMはオートファジーを調節し、その後、内細胞のトラフィッキングを介してタウのターンオーバーを調節する [89]。
  • KAT8はヒストンアセチルトランスフェラーゼであり、その過剰発現はオートファジーのフラックスを増加させる [90]。
  • WWOX(WWドメイン含有酸化還元酵素)は、mTORとの直接的な相互作用を介してオートファジーを抑制し、Beclin-1,Atg12-Atg5およびLC3-IIレベルの低下をもたらす[91]。
  • 最後に、MAPT/tauはESCRT-III複合体の形成を阻害することで、オートファゴソームとリソソソームの融合を抑制し、LC3-II、p62,オートファゴソームの蓄積を引き起こすことが示されている[92]。

7. アルツハイマー病発症におけるオートファジーの役割

アミロイドβタンパク質を含む老人性プラークと高リン酸化タウタンパク質からなる神経原線維性タングル(NFT)は、アルツハイマー病の病理学的特徴である[93]。老人性アミロイドβプラークはアルツハイマー病に特異的であるのに対し、NFTはいくつかのタウ病に見られ、神経変性の一般的なマーカーである。アミロイドβは、アミロイド前駆体タンパク質(APP)によって、β-セクレターゼおよびγ-セクレターゼによるN末端およびC末端でのタンパク質分解的切断を経て産生されるアミロイド原性タンパク質である[94]。アミロイドβのアミノ酸残基数は39から43まであり、アミロイドβ40が最も優勢である[95]。しかし、Aβ42は、AD脳の老人斑では主な毒性種であり、タンパク質成分である傾向がある[96]。脳内では、正常な生理状態ではアミロイドβ42は低レベルで存在する。しかし、病理学的状態では、アミロイドβ42は高濃度で存在し、神経細胞機能に悪影響を及ぼす。アミロイドβ42は非常に凝集しやすく、小さなオリゴマーから成熟したフィブリルまでの複数のアイソフォームを形成することができる。増加する証拠は、可溶性アミロイドβ42オリゴマーが主な毒性種であることを示しているが、プラーク(ほとんどが不溶性フィブリルを含む)は比較的不活性であり、細胞機能障害の発症に二次的に寄与するものと考えられており、時にはオリゴマー毒性を制限するための保護機構でさえある[97]。

オートファジーの機能不全は、細胞のシグナル伝達経路の障害[98]およびアルツハイマー病におけるアミロイドβおよびタウタンパク質凝集体の蓄積の増加に関与している[99,100]。正常な加齢とは対照的に、オートファジー小胞(AV、オートファゴソーム、リソソーム)の過剰な蓄積がアルツハイマー病患者の死後脳で観察されている[101,102,103]が、AVの蓄積がオートファジー機能不全の結果であるのか[102,104]、あるいは過剰なオートファジーによるものであるのかという疑問を提起している[105]。オートファジーは栄養シグナル伝達キナーゼAMPKによって制御されており、その制御障害はアルツハイマー病におけるオートファジー機能不全や神経変性に寄与することが提案されている[106]。AMPKは、ストレス時にオートファジーを制御するキナーゼの能力を調節する非触媒的調節ガンマサブユニットPRKAG2(プロテインキナーゼAMP-activated non-catalytic subunit gamma 2)を含む3つのサブユニットで構成されるヘテロ三量体タンパク質複合体である。PRKAG2ホモログであるSNF4Aγは、アルツハイマー病のミミズバエモデルにおける発達およびストレス誘発オートファジーの調節に必要であることがわかった[107]。我々のグループの最近の研究成果では、PRKAG2遺伝子の発現がアルツハイマー病海馬とアルツハイマー病前頭前野で3倍に増加し、そのタンパク質レベルが脳内のアミロイドβ蓄積と正の相関を示すことが示されている[108]。酵母では、アミロイドβ42の発現がオートファジーを活性化することを示し、SNF4(PRKAG2ホモログ)を共発現させると、アミロイドβ42凝集体とオートファジー活性が著しく低下することを示した[109]。全体的に、これらの知見は、オートファジー活性化とPRKAG2の発現の増加が、アルツハイマー病脳におけるアミロイドβ蓄積の増加への応答である可能性を示している。我々の研究はまた、PRKAG2のような遺伝子の活性化の低下が、アルツハイマー病におけるアミロイドβ蓄積と神経変性への重要な貢献者かもしれないことを示唆している。

新しいオートファゴソームの形成、オートファゴソームの成熟、リソソーム分解によるクリアランスの間の平衡は、オートファジーフラックスとして知られており、神経変性疾患の病態を理解する上でますます重要な概念となってきている。神経変性状態においてAVが常に存在することは、オートファジーが誘導されていることを示している[110]。新たに形成されたオートファゴソームは、通常、リソソソームと融合して神経細胞内で除去され、健康な脳では通常見られないオートファゴ中間体の蓄積を防ぐことができる[111,112]。AVのクリアランスは、オートファゴソーム-リソソーム輸送の阻害によって、またはアルツハイマー病脳で、PS/APP、プレセニリン-1,PS1(M146L)の家族性アルツハイマー病変異を発現する二重トランスジェニックモデルでAVの大規模な蓄積で、その結果、基質のタンパク質分解をブロックすることによって妨害することができる[110]。

過剰なオートファジーに加えて、アルツハイマー病におけるオートファゴソームの成熟やリソソームとの融合、あるいは神経細胞体への輸送の障害が証拠として示されている。エンドソーム-リソソーム間の輸送機能の障害は、死後のヒトの脳やマウスのADモデルでもAVの蓄積とともに観察されている[112,113]。マウス胚盤胞を用いた研究では、プレセニリン-1(PS1)の変異がアミロイドβクリアランスの欠如を引き起こすことが示されている。PS1はオートファジーおよび内分泌タンパク質基質のリソソームターンオーバーに必要であり、その欠失はオートリソーム酸性化およびカテプシン活性化(システインカテプシンはリソソーム内でのタンパク質分解に関与するプロテアーゼである)の障害によるオートファジー機能の喪失を引き起こした[113,114]。したがって、ADマウスモデルにおけるリソソームカテプシン活性の増強は、AV内のユビキチン化タンパク質および他のオートファジー基質の蓄積を減少させ、細胞外および総脳アミロイドβ沈着を減少させた。これらの研究は、アルツハイマー病において顕著なリソソソーム機能障害が存在することを示唆している。ADマウスモデルでは、樹状突起におけるオートファゴソームの蓄積は細胞外プラーク形成に先行しており、オートファジーは初期の反応であり、末期病期のプラーク形成の結果としてではないことを示している[115]。さらに、APP、PS1およびアミロイドβペプチドの生成に必要な他の基質は、ADマウスの肝臓の単離されたAVで同定された[114]、アミロイドβ生成におけるAVの潜在的な役割を示唆している[116]。アルツハイマー病患者の前頭前野中層灰白質での研究では、Beclin-1タンパク質レベルの低下が認められた。さらに、ADマウスモデルでは、ベクリン-1発現の低下は、脳内および細胞外へのアミロイドβ蓄積、神経異常、神経変性の増加をもたらした[117]が、アルツハイマー病病態におけるオートファジー阻害の役割をさらに支持している。

 

ミクログリア細胞は中枢神経系の免疫系を代表する細胞である。ミクログリアは脳と脊髄全体に存在し、中枢神経系内に見られる全細胞の10-15%を占めている[118]。プラーク、損傷したニューロンや微生物をスカベンジする脳内の防御機構の初期および主要な形態であることに加えて、ミクログリアは、開発中の脳全体のメンテナンスとシナプス剪定のために重要である。アルツハイマー病脳の老人斑の周りに活性化されたミクログリアの観察はよく文書化されている[119,120]。中枢神経系におけるオートファジーは、主にニューロンで研究されているが、ミクログリアを含む他の細胞タイプではほとんど未踏のままである。

グリア細胞はアミロイドβを内部に取り込むことができ、そのクリアランスに関与している[121,122,123,124]。アミロイドβへの曝露は、豊富なグリア細胞であるアストロサイトを活性化するが、慢性的な曝露はオートファジーを過剰に活性化させ、グリア炎症性サイトカインや一酸化窒素の放出を誘発し、神経細胞やグリア細胞の死につながるという有害な結果をもたらす可能性がある[125]。

最近の研究では、アミロイドβ病理の異なる段階でADマウスの海馬におけるグリアとオートファジーの変化を報告した。興味深いことに、ミクログリアの形態の変化は、アミロイドβプラーク沈着の前に観察され、グリア細胞のオートファジーの増加は、アミロイドβ沈着と関連していた[126]。プラーク周辺のアストロサイトはLC3の増加を示した。さらに、炎症性マーカーであるIba1(イオン化カルシウム結合アダプター分子1)は、ユビキチンやp62と共局在しており、ミクログリアに排他的に存在していた[126]。全体的に、これらの知見は、グリアにおけるオートファジーの障害が、アミロイドβプラーク沈着に先行する初期のイベントであることを示している。したがって、可能性のある介入のタイミングには特に注意を払うべきである。

8. アルツハイマー病のためのオートファジー治療薬

アルツハイマー病のような慢性的な老化疾患は、タンパク質分解機構の機能不全を促進する分子および細胞環境の形成を支持し、それによって、そのようなアミロイドβやタウなどの凝集体傾向のあるタンパク質の蓄積。上記のように要約すると、アルツハイマー病は、中心的な病態生理学的因子であると推定されている異常なオートファジーの特徴を示している。

オートファジー障害の結果は、それが発生した段階によって異なる。

オートファゴソーム形成のレベルで発生し、誤って折り畳まれたタンパク質および/または機能不全小器官のような廃棄された貨物の蓄積をもたらすかもしれない[1,31,127]、

またはオートファジー貨物を認識しないことで発生するかもしれない。しかしながら、結果は同じであり、機能不全の認識の程度とカーゴの種類に依存する。

第三のレベルの欠陥は、オートファゴソームが適切に除去されずに蓄積された場合に生じる可能性がある。これは、細胞内のトラフィッキングを妨害し、アルツハイマー病で見られる神経細胞の損失につながる可能性がある[113]。

 

薬理学的にオートファジーを改変することは、凝集したタンパク質の除去を促進することにより、アルツハイマー病を予防または停止させるための魅力的なアプローチであり、その結果、機能不全や死から細胞を保護することができる[128]。しかしながら、特定のオートファジー障害を特定することは、治療戦略の開発に不可欠である[129]。オートファジーの誘導は、ADモデルにおける可溶性種と凝集種の両方のレベルを低下させ、有益な効果と関連している[130,131,132,133,134,135]。

多くのオートファジー促進分子が開発されており[76,77]、それらの治療効果は以前に広範囲にレビューされている[136,137]。オートファジー誘導剤は、mTOR依存性またはmTOR非依存性の2つの主要なグループに分類される。mTOR阻害剤は、ATP競合性阻害剤(例:Torin1)または非ATP競合性阻害剤(例:ラパマイシンおよびラパログ)のいずれかである[138]。

mTORC1,mTORC2,および場合によってはホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)活性の阻害のため、動物におけるmTOR活性のATP競合性阻害剤の慢性投与は、重大な毒性の問題を提示する[138]。しかしながら、ラパマイシンおよびその類似体のような非ATP競合性阻害剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病(PD)ハンチントン病(HD)およびプリオンタンパク(PrP)疾患の動物モデルにおいて、オートファジー誘導剤としての利点を示している[127,133,139,140,141,142]。これらの薬剤は、非ATP競合性の作用モードおよびmTORC1に対する選択性により、比較的安全なプロファイルを有しており[143]、実際、ラパログであるエベロリムスは、最近、結節性硬化症の治療薬として食品医薬品局(FDA)により承認された。

 

多くのmTOR非依存性オートファジー活性化剤はAMPKを標的とする。トレハロースは、神経変性モデルにおけるオートファジー誘導因子として広く研究されている[66]が、AMPK活性化因子として特徴づけられている[144]。トレハロースの分子標的は、グルコーストランスポーターの一族であるGLUTタンパク質であり、その阻害によりAMPKが活性化される[144]。マウスへのトレハロース投与は、アルツハイマー病、PD、前頭側頭葉認知症(FTLD)HD、SCA17,PrP、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む広範な神経変性疾患モデルにおいて、オートファジー誘導と同時に治療効果を示している[145]。

メトホルミンは別のAMPK依存性オートファジー誘導薬であり、アルツハイマー病、HD、ラフォーラ病を含む神経変性の動物モデルにおいて有益な効果が示されている[146]。

リルメニジン、クロニジン、ミノキシジル、ベラパミルなど、サイクリックAMP(cAMP)/イノシトール三リン酸(IP3)を含む他の経路に作用するオートファジー誘導剤が、ますます多く同定されている[102]。

我々のグループは以前に、低分子抗ヒスタミン薬であるラトルピルジンがオートファジーを活性化し、アルツハイマー病およびパーキンソン病の酵母および動物モデルにおいてアミロイドβ病理を減少させることを実証した[147,148,149]。さらに最近、我々は、酵母におけるアミロイドβ42毒性を測定するための迅速吸光度ベースのアッセイの使用を開発した[148]。ここで、我々は、オートファジーの生理的(窒素飢餓)および化学的誘導剤(ラトルピルジン、ラパマイシンおよびラパマイシン28の低分子エンハンサー)によって付与されるアミロイドβ42毒性に対する保護のレベルに有意な差を示した。要約すると、我々の知見は、オートファジー誘導がアルツハイマー病におけるオリゴマーアミロイドβ42媒介の細胞死および神経変性に対する予防的治療法としての証拠を提供する。

 

オートファジーフラックスは、一般的にオートファジー分解能力の指標として定義されており、アルツハイマー病治療法の開発にとって決定的に重要な概念であると考えられるようになってきている。しかし、オートファジー機構のさまざまな分子的側面の測定における著しい進歩にもかかわらず、信頼性が高く、感度が高く、定量化可能な方法でオートファジーフラックスを測定することは、依然として課題となっている。さらに、オートファゴソームのフラックスは基質クリアランスフラックスとは異なる可能性があることに留意すべきである。さらに、カーゴタンパク質の発現レベルは経時的に影響を受ける可能性があり、リソソーム分解による遊離アミノ酸生成に依存する可能性がある。

ラパマイシン、トレハロース、リチウムなどの介入は様々な疾患モデルで使用されているが、細胞タイプ、治療濃度、および治療期間の違いにより、オートファジーフラックスに対するこれらの薬剤の効果の解釈は困難である[150]。

アルツハイマー病におけるオートファジー機能不全を明確に理解し、効果的なオートファジーベースの治療法を開発するためには、オートファジー活性をリアルタイムでモニターし、オートファジー調節の治療効率を評価するために臨床現場で応用できるバイオマーカーを測定できることが非常に重要である。現在、哺乳動物細胞におけるオートファジーを確実に測定するためのいくつかの方法が開発されている。要約すると、(1)LC3-I(細胞質形態)からLC3-III(膜結合脂質形態)およびp62への変換の検出を含む免疫ブロット分析、(2)リソソソーム阻害剤の有無による2つのサンプルの比較によるLC3ターンオーバーの検出、および(3)電子顕微鏡によるオートファゴソームおよびオートリソソームの検出を含む顕微鏡法を含む。(4)蛍光顕微鏡による細胞あたりのパンクテート構造の平均数をカウントするGFP-LC3(または内因性LC3)パンクテート形成アッセイの検出、(5)抗GFP抗体を用いた免疫ブロッティングによるオートリソソーム内でのGFP-LC3の分解により生成されるGFPフラグメントの検出[151]。哺乳類細胞におけるオートファジーをモニタリングする方法は、ここ数十年で大幅に改善されてきたが、依然として大きな課題を抱えている。第一に、動的なプロセスを定量的に測定するという課題と、エンドポイント測定に基づく推論に関連した固有の限界がある。第二に、オートファジーオルガネラの不均一性(すなわち、成熟の異なる段階で複数のオートファジー由来のオルガネラが発生すること)という課題があり、これを正確に調べることは非常に困難である。

9. 結論

オートファジーは、細胞の恒常性と生存の維持に重要な役割を果たしており、変異体/ミスフォールドされたタンパク質のクリアランスを促進している。オートファジーの分子機構や細胞機構の理解が大きく進展しているにもかかわらず、どのような状況下で「オートファジーの増強」が細胞死に関与しているのか、あるいは保護効果を持つレスキュー機構であるのかについては、まだ明らかになっていない。さらに、オートファジーが細胞死を直接引き起こすのか、それともアポトーシスの二次的な効果なのかは、まだ明らかにされていない。

オートファゴソームの数の増加は、必ずしもオートファジーの亢進を示すものではないことに留意すべきである。

また、オートファゴソームの数の増加は、リソソソームとの融合がうまくいかないために、未クリアなオートファゴソームが蓄積しているか、あるいは様々なオートファジー誘導経路のいずれかの機能不全を示している可能性がある。

 

結論として、アルツハイマー病におけるオートファジーの刺激は、破壊的になりうる過剰な刺激を避ける限り、神経保護戦略としての可能性を持っているかもしれない(図3)。オートファジーの改変は、多様な結果をもたらし、まだ解明されていないメカニズムに干渉する可能性があることを考慮する必要がある。オートファジーに関わる分子機構や、このプロセスが神経細胞の生存・死の経路に果たす役割を明らかにすることで、オートファジーの阻害や刺激がアルツハイマー病の治療に役立つかどうかを判断することが可能になるはずである。

治療の観点からは、オートファジーが有望な標的であることを示すエビデンスが全体的に示されていると考えている。オートファジーのアップレギュレーションは、タンパク質凝集体のクリアランスに加えて、死に至る前の障害に対する感受性を低下させることで、さらなる保護効果を発揮する。

治療アプローチとしてのオートファジーアップレギュレーションの利点の一つは、オートファジーの効果を改善するためには、特定の構成要素を標的とした戦略で十分であるため、経路の構成的な活性化は必要ないかもしれないということである。

図3 アルツハイマー病におけるオートファジー活性化の保護作用と有害作用

A)正常な状態では、オートファジー活性化は、軸索末端の恒常性、膜リサイクル、シナプス前機能、神経毒の除去を調節することにより、機能的なリソソソームクリアランスを持つ健康なニューロンでは保護機構として機能する。

B)ヒトのアルツハイマー病脳に見られるような病原性条件下では、オートファジー活性化は、既存のタンパク質凝集と機能不全のリソソームクリアランスを有するニューロンにおいて有害になる可能性がある。さらに、オートファジー活性化は、潜在的に未熟なオートファゴソームの蓄積の増加、オートファゴソームとリソソームの融合の障害、または本質的な小器官の過剰な分解、自己消化および神経細胞死につながる可能性がある。

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